四川某些規(guī)?；i場大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性監(jiān)測

舒 蕾，萬 莉，張 琦，馬 磊，謝智勇，楊 映，郭 玲，顏其貴，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心，四川 雅安625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安625014）

大腸桿菌病是人畜共患的腸道細(xì)菌性傳染病。在畜牧生產(chǎn)中致病性大腸桿菌可引發(fā)豬大腸桿菌病，主要有仔豬黃痢、仔豬白痢及仔豬水腫病典型病癥，其在規(guī)?；i場中發(fā)病率和死亡率均較高，造成經(jīng)濟(jì)損失巨大，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)和臨床治療過程中針對豬細(xì)菌病常使用抗生素，抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性變化，表現(xiàn)出對多種抗生素具有抗性，使得細(xì)菌性疾病防治現(xiàn)狀嚴(yán)峻。為調(diào)查四川某地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性流行和發(fā)展現(xiàn)狀，本試驗(yàn)自該地區(qū)隨機(jī)采集8個規(guī)?；i場的仔豬黃、白痢病料，進(jìn)行耐藥性監(jiān)測與耐藥譜型分析，旨在為該地區(qū)臨床用藥和細(xì)菌耐藥性相關(guān)研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2011年3～4月期間在四川某地區(qū)隨機(jī)采集不同區(qū)域典型的8個規(guī)?；i場進(jìn)行病料收集。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)小鼠購于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，雌雄各半，每只體重20g±2g。

1.3 主要試劑 MH培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌生化鑒定管和藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏質(zhì)控菌株標(biāo)準(zhǔn)株ATCC2592，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；其他試劑實(shí)驗(yàn)室制備。

1.4 試驗(yàn)儀器 試驗(yàn)儀器均為常規(guī)設(shè)備。

1.5 病料采集 調(diào)查走訪該轄區(qū)8個規(guī)?；i場，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查后收集仔豬黃、白痢發(fā)病豬的新鮮糞便80份，具體采集、保存方法參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。

1.6 病原分離純化 挑取病料與麥康凱平板上劃線接種，37℃，培養(yǎng)18h，挑取單個粉紅色菌落接種于伊紅美藍(lán)平板純化，37℃，培養(yǎng)18h，挑取有紫黑色帶金屬光澤的單個菌落于營養(yǎng)肉湯中，37℃搖床擴(kuò)大純培養(yǎng)。

1.7 生化鑒定 取純化后新鮮菌液接種TSI和細(xì)菌生化鑒定管，方法及判定結(jié)果參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。

1.8 致病性試驗(yàn) 用無菌生理鹽水將分離新鮮培養(yǎng)菌液稀釋到0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽?×108CFU／mL），吸取稀釋菌液0.2mL分別腹腔注射健康小鼠，總體設(shè)空白對照鼠，腹腔注射無菌生理鹽水0.2mL，隔離飼養(yǎng)，觀察其發(fā)病及存活情況。及時剖檢死亡小鼠，取肝臟劃線于麥康凱平板進(jìn)行細(xì)菌分離，染色、鏡檢結(jié)果符合大腸桿菌特征的菌株確定為致病性大腸桿菌。方法及結(jié)果判定參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。

1.9 耐藥性監(jiān)測 對鑒定為致病性大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，試驗(yàn)采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會CLSI［2］推薦的K－B法進(jìn)行，結(jié)果判定依據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離鑒定 80份病料中分離到78株大腸桿菌，分離率為97.5%。78株大腸桿菌的TSI及生化試驗(yàn)結(jié)果均符合腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定特征，即TSI出現(xiàn)斜面底層變黃、有氣體；生化鑒定分離菌可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、木糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，少數(shù)能發(fā)酵蔗糖，M.R.試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陽性，尿素酶、檸檬酸鹽、枸櫞酸鹽、V－P試驗(yàn)為陰性。

2.2 致病性試驗(yàn) 對分離出的78株大腸桿菌進(jìn)行致病性試驗(yàn)，其中70株接種試驗(yàn)小鼠48h內(nèi)死亡，取死亡小鼠肝臟分離到原接種菌，由此證明這70株大腸桿菌有致病性。

2.3 藥敏試驗(yàn)

2.3.1 藥敏結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，70株不同豬場的大腸桿菌對阿莫西林、紅霉素高度耐藥，耐藥率分別為100%、82.86%，敏感性最高的為喹諾酮類氧氟沙星、頭孢類頭孢唑啉，敏感率分別為82.86%、60%，對其他5種抗菌藥物均存在較為嚴(yán)重的耐藥性，耐藥率在50%以上的有氨芐西林、慶大霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星，其中林可霉素和甲氧芐啶呈中度敏感。

2.3.2 耐藥譜 對多重耐藥性分析結(jié)果（圖1）表明，該地區(qū)的菌株對所試12種藥物表現(xiàn)為嚴(yán)重的多重耐藥，所有菌株至少對三種藥耐藥，最高達(dá)11耐，大部分呈6耐、8耐及9耐，總比例高達(dá)51.43%，平均耐受7種所試藥物。

表1 致病性大腸桿菌對常用抗菌藥物的耐藥性

圖1 致病性大腸桿菌對常用抗菌藥物的多重耐藥譜

2.3.3 耐藥譜型 對抗菌藥物耐藥譜型分析，共有39種耐藥譜型；其中11重耐藥譜型有2種，4重和7重耐藥譜型均有3種，3重、5重和10重耐藥譜型均有4種，8重耐藥譜型均有5種，9重耐藥譜型有6種，6重耐藥譜型均有8種。

3 討論與分析

3.1 大腸桿菌為條件性致病菌，豬瘟、傳染性胃腸炎等病毒性疾病也會繼發(fā)感染大腸桿菌病。仔豬黃、白痢的發(fā)生主要由于飼養(yǎng)管理不善，衛(wèi)生條件差，環(huán)境溫差變化等綜合應(yīng)激因素引起仔豬抵抗力降低而誘發(fā)的。所以，該地區(qū)規(guī)?；i場應(yīng)改善飼養(yǎng)管理，減少應(yīng)激發(fā)生；產(chǎn)前母豬可進(jìn)行疫苗免疫，通過泌乳使仔豬獲得母源抗體；積極進(jìn)行藥物敏感性監(jiān)測，選擇有效抗菌藥物預(yù)防；加強(qiáng)環(huán)境消毒，防止耐藥菌株的交叉?zhèn)鞑ズ透腥?；選擇使用黃芪多糖等，增強(qiáng)動物機(jī)體抵抗力，減少疾病發(fā)生；運(yùn)用微生態(tài)制劑改善腸道微環(huán)境，防止正常菌群發(fā)生紊亂。

3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)反應(yīng)了該地區(qū)各豬場在抗菌藥物的使用上有一致性，臨床使用頻率較高的藥物已對本病的防治效果不佳，如阿莫西林、紅霉素；氨芐西林、慶大霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星這幾類常用藥物存在較高耐藥性，耐藥率均大于50%，這與田國寶等［3］報道的四川地區(qū)規(guī)模化豬場大腸桿菌耐藥性有所差異，2007年四川地區(qū)敏感藥物為丁胺卡那霉素（97.3%）、新霉素（95.4%）、慶大霉素（91.7%）、頭孢唑啉（94.4%），而紅霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素的敏感性最低，但本次試驗(yàn)結(jié)果表明，敏感藥物為氧氟沙星（82.86%），其次是頭孢唑啉（60%），敏感性明顯降低，且敏感藥物顯著減少；所有試驗(yàn)菌株至少對3種藥耐藥，豬源大腸桿菌多重耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重，這與林居純等［4］對我國不同地區(qū)大腸桿菌有多重耐藥性結(jié)果相似。本次試驗(yàn)地區(qū)有51.43%的菌株耐藥譜達(dá)7耐及7耐以上，這相比陳希文等［5］報道的四川綿陽地區(qū)豬源致病性大腸桿菌的耐藥譜有所降低；對耐藥譜型分析結(jié)果與楊澤曉等［6］對四川省部分地區(qū)大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測結(jié)論一致，相同耐藥程度的分離菌有多種耐藥譜型，耐藥譜型在增寬。且慶大霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率高于四川其他地區(qū)。這與不同地區(qū)菌株的遺傳差異、豬場臨床用藥差異等因素有關(guān)。

細(xì)菌的耐藥性通過染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)在細(xì)菌間傳播和擴(kuò)散，不合理或?yàn)E用抗生素加速了豬大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散，這導(dǎo)致畜牧業(yè)疾病防治用藥難度加大。通過本次試驗(yàn)得出，該地區(qū)豬場在臨床防治中應(yīng)選用敏感性高的氧氟沙星、頭孢唑啉，禁止使用耐藥程度高的阿莫西林、紅霉素，對其他中度敏感藥物可合理采取聯(lián)合、交叉、輪換用藥。

3.3 近年來新耐藥菌株的出現(xiàn)，給獸醫(yī)臨床施藥帶來巨大考驗(yàn)，促使我們開發(fā)新型藥物。在獸醫(yī)臨床用藥中使用抗生素時我們要正確診斷、對癥下藥，掌握藥性，正確選藥，規(guī)范用法，合理劑量，注意個體差異，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理；另外，中獸藥在獸醫(yī)臨床用藥中應(yīng)用逐漸增多，中藥為天然植物，具有低殘留、毒副作用小、藥效時間長、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，其療效也逐漸被公眾所認(rèn)可，越加凸顯其優(yōu)勢。已有研究證實(shí)，中藥是直接作用于細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和代謝而產(chǎn)生抗菌作用［7］，張庭延等［8］從中藥金櫻子中提取出多糖類物質(zhì)進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果對大腸桿菌等具有很強(qiáng)抑制作用。因此，將中藥運(yùn)用于規(guī)?；i場疾病的防治中，是解決耐藥問題的另一途徑。

［1］陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：215－223.

［2］CLSI Document M31－S1，Clinical and Laboratory Standards Institute［S］.

［3］田國寶，王紅寧，黃勇，等.規(guī)模化豬場大腸桿菌耐藥性和血清型變化趨勢［J］.中國獸醫(yī)雜志，2007，43（10）：31－33.

［4］林居純，卓家珍，蔣紅霞，等.不同地區(qū)豬源和禽源大腸桿菌耐藥性監(jiān)測［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，30（1）：86－88.

［5］陳希文，王雄清，代敏，等.綿陽地區(qū)豬源致病性大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（1）：131－134.

［6］楊澤曉，龐歌，王印，等.四川省部分地區(qū)大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測［J］.畜牧與獸醫(yī)，2011，43（2）：84－87.

［7］解慶林，鄒堂斌，潘百明，等.中藥抗菌作用及逆轉(zhuǎn)耐藥性機(jī)制研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2010（5）：30－31.

［8］張庭延，聶劉旺，劉愛民，等.金櫻子多糖的免疫活性研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2005，11（4）：55－58.