胰島素對(duì)雛雞心肌發(fā)育及其超微結(jié)構(gòu)的影響

秦 健，吳榮富，杜 榮，楊亞群，張紅強(qiáng)，曹海霞，辛 香

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院電鏡中心，山西 太谷030801；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇 揚(yáng)州225003；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素，是動(dòng)物體內(nèi)降低血糖，促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的重要激素，在機(jī)體的代謝調(diào)節(jié)和生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。心肌是動(dòng)物體的重要組成部分，是胰島素作用的一個(gè)重要靶器官。因此，研究胰島素對(duì)心肌發(fā)育的影響具有重要意義。有研究表明，胰島素可以改善糖尿病大鼠損傷的心肌超微結(jié)構(gòu)，對(duì)心肌具有保護(hù)作用［1］。胰島素早期干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞具有抗凋亡作用［2］。然而，關(guān)于胰島素對(duì)正常動(dòng)物心肌發(fā)育及其超微結(jié)構(gòu)的影響，特別是針對(duì)禽類的研究，則鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過給雛雞注射適量胰島素，分析其對(duì)心肌發(fā)育及其超微結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步深入研究胰島素對(duì)心肌發(fā)育和代謝的分子細(xì)胞機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為在實(shí)踐中更好地利用胰島素抗應(yīng)激、抗疾病并促進(jìn)生長(zhǎng)提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選用16只體重約200g的健康雛雞，隨機(jī)分成兩組，常規(guī)飼養(yǎng)和管理，自然光照，自由采食和飲水。

1.2 主要試驗(yàn)試劑 胰島素注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）、0.9%生理鹽水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、四氧化鋨酸、0.1mol／L磷酸緩沖液、2.5%磷酸緩沖的戊二醛固定液、1%磷酸緩沖的四氧化鋨固定液、無水乙醇、無水硫酸銅、環(huán)氧丙烷、Epon812、DDSA、MNA、DMP－30、醋酸雙氧鈾、硝酸鉛、檸檬酸鈉。

1.3 主要儀器和器材 日本電子GEOL－1400透射電鏡、LEICA EM KMR2制刀機(jī)、LEICA EM UC6超薄切片機(jī)（Leica，Austria）、XTB－I型連續(xù)變倍體視鏡、DG／20－002型臺(tái)式干燥箱（重慶試驗(yàn)設(shè)備廠制造）、SC－210F白雪牌商用陳列柜、SE202F型電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)）、D系列超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)）、BCD－197KZ型新飛冰箱、SPR－1水平振蕩器。

2 試驗(yàn)方法及分析

2.1 動(dòng)物處理方法 試驗(yàn)組8只雛雞每天定時(shí)腹腔注射1mL胰島素注射液（0.4單位／mL），對(duì)照組8只雛雞腹腔注射等體積生理鹽水。連續(xù)注射10d后，禁食，稱重，解剖取出心臟，稱重，并迅速剖出1mm3相同部位心室肌組織2塊，放入預(yù)冷的2.5%的戊二醛固定液中。

2.2 電鏡樣本制作及分析 在4℃2.5%戊二醛固定液固定24h，PBS漂洗；1%鋨酸固定液固定1.5 h，PBS漂洗；乙醇梯度脫水，環(huán)氧丙烷過渡，環(huán)氧丙烷和Epon812樹脂的混合液浸透2h；純Epon812樹脂浸透過夜、包埋，干燥箱中聚合48h；半薄切片定位，50～70nm超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色；JEOL－1400透射電鏡觀察拍照。心肌線粒體橫截面積采用Gantan Digital Micrograph軟件（Gatan Inc.USA）定量分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。兩組間差異顯著性分析用兩樣本均數(shù)差別的t檢驗(yàn)，P＜0.05為組間差異具有顯著性，P＜0.01為組間差異極顯著。作圖采用Excel 2007軟件。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 試驗(yàn)期末雛雞的體重和心肌重量 見表1。

表1 雛雞體重、心肌重和心體比

試驗(yàn)期末，試驗(yàn)組與對(duì)照組雛雞的體重、心肌重和心體比均差異不顯著（P＞0.05）（表1）。表明在本試驗(yàn)的注射劑量和注射時(shí)間下，胰島素對(duì)雛雞的生長(zhǎng)發(fā)育未產(chǎn)生顯著影響。

3.2 超微結(jié)構(gòu)觀察 8 000倍電鏡下觀察雛雞心肌肌原纖維超微結(jié)構(gòu)（圖1），對(duì)照組和試驗(yàn)組均可見結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞核（N），核仁清晰，核染色質(zhì)均勻，結(jié)構(gòu)正常的線粒體（Mi），清晰完整的肌絲（mf），排列整齊的Z線，粗細(xì)均勻的肌節(jié)，A帶中有粗肌絲和細(xì)肌絲交錯(cuò)排列，肌原纖維或肌絲之間可見糖原顆粒（Gl）。

定量分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肌細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量和面積均明顯增加（P＜0.05）（圖2和圖3）。

80 000倍電鏡下進(jìn)一步觀察雛雞心肌細(xì)胞線粒體（Mi）超微結(jié)構(gòu)（圖4），對(duì)照組和試驗(yàn)組均可見完整清晰的線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)、內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成許多嵴（Ci）、嵴長(zhǎng)而密，呈平行排列，嵴間腔內(nèi)由無定形物質(zhì)或細(xì)粒狀物質(zhì)構(gòu)成，呈中等電子密度。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組線粒體明顯變大，嵴更加清晰，并且嵴間腔面積增加，基質(zhì)更為豐富。

圖4 雛雞心肌超微結(jié)構(gòu) （80 000×）

4 討論與分析

胰島素通過調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和能量代謝對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育等起著至關(guān)重要的作用。而線粒體作為動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換器，是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和形成ATP的主要場(chǎng)所。對(duì)人類和小鼠等哺乳動(dòng)物的研究表明，胰島素與線粒體的發(fā)生及功能有關(guān)。有研究表明，胎牛骨骼肌中線粒體蛋白的含量與血清胰島素的增加呈正相關(guān)［3］。Pawlikowska等（2006）通過體外培養(yǎng)的細(xì)胞研究表明，線粒體是胰島素介導(dǎo)肌生成的必需細(xì)胞器，而胰島素又能刺激線粒體的發(fā)生和促進(jìn)線粒體的功能［4］。

心肌細(xì)胞由于其高效的收縮功能，其線粒體含量比骨骼肌更為豐富，線粒體的氧化磷酸化是心肌能量的主要來源。而心肌細(xì)胞又含有大量胰島素受體，是典型的胰島素靶細(xì)胞。所以胰島素對(duì)心肌線粒體的發(fā)生及功能具有重要的意義。在心肌梗死小鼠，胰島素信號(hào)受損降低了線粒體的氧化功能［5］。另有研究表明，胰島素信號(hào)受阻明顯促進(jìn)了小鼠心肌線粒體的氧化應(yīng)激和解偶聯(lián)［6］。本試驗(yàn)短期內(nèi)給雛雞注射生理劑量的胰島素后對(duì)其體重和心體比雖未產(chǎn)生顯著影響（表1），但明顯影響了心肌的超微結(jié)構(gòu)，如糖原顆粒增加、線粒體數(shù)量增加和體積增大（圖1～4）。而且大量圖片的觀察結(jié)果表明，線粒體數(shù)量和體積增加的同時(shí)，線粒體的結(jié)構(gòu)也有所改善，如嵴間基質(zhì)面積增加。這些結(jié)果表明，適量補(bǔ)充生理劑量的胰島素可以通過增加線粒體的發(fā)生和提高線粒體的功能而改善正常雛雞心肌的代謝功能，從而提高雛雞的生長(zhǎng)發(fā)育和抗應(yīng)激、抗疾病能力。胰島素增加線粒體數(shù)量和體積的原因可能是細(xì)胞對(duì)代謝加強(qiáng)的一種適應(yīng)性反應(yīng)。從小鼠等哺乳動(dòng)物的一些研究結(jié)果推測(cè)，胰島素提高禽類心肌線粒體功能的機(jī)制，可能與下列因素有關(guān)：胰島素刺激可以激活PI3K－Akt途徑，誘導(dǎo)Akt磷酸化并促進(jìn)Akt向心肌線粒體遷移［7］；胰島素信號(hào)可以通過維持線粒體生物發(fā)生和作用過程中的一些關(guān)鍵介質(zhì)如NAD＋／NADH比例等而加強(qiáng)線粒體電子傳遞鏈的完整性和活性［8］。有關(guān)胰島素促進(jìn)線粒體發(fā)生和增殖機(jī)制的研究較少，而且禽類具有不同于哺乳動(dòng)物的一些生理機(jī)制，因此有關(guān)生理劑量胰島素促進(jìn)禽類心肌線粒體發(fā)生和功能的確切分子和細(xì)胞機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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