奧氮平增加大鼠H9C2心肌細(xì)胞巨噬細(xì)胞遷移抑制因子基因和蛋白表達(dá)☆

邢夢(mèng)娟 Dake Qi 張成芳 丁文華 江開達(dá) 馬端 崔東紅

第二代抗精神病藥物（second generation antipsychotics，SGA）奧氮平是治療各種精神疾病尤其是精神分裂癥、雙相情感障礙等最廣泛的臨床用藥之一。在其表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗精神病作用、較少神經(jīng)系統(tǒng)副作用的同時(shí)，卻引起代謝障礙的不良反應(yīng)，如體重增加、胰島素抵抗、糖尿病、心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）等［1，2］，而后者是精神分裂癥患者死亡的主要原因［3］。臨床［4］、隊(duì)列［5］及流行病學(xué)研究［6］均提出SGA可以增加CVD風(fēng)險(xiǎn)，甚至引起致死性心臟?。?］，但具體的機(jī)制尚不清楚。MIF是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，參與多種炎癥反應(yīng)，在心血管疾病中也發(fā)揮關(guān)鍵的作用［8］，甚至有學(xué)者提出 MIF在 CVD的發(fā)病中起直接作用［9］。Schober等［10］應(yīng)用 MIF基因敲除小鼠的研究也指出MIF可能就是動(dòng)脈粥樣硬化的病因。然而抗精神病藥物引起的心血管事件是否通過(guò)MIF通路尚無(wú)報(bào)道。本研究采用培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞來(lái)探索奧氮平是否影響大鼠H9C2心肌細(xì)胞MIF的表達(dá)，為探討奧氮平誘導(dǎo)心血管疾病的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 大鼠心肌細(xì)胞H9C2（H9C2細(xì)胞系，ATCC號(hào)CRL-1446上海中科院）

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 奧氮平純品（大連美侖）。奧氮平用DMSO溶解，加到不含血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別配成含40、20和10 umol奧氮平的培養(yǎng)液，DMSO最終濃度不超過(guò)0.1%，對(duì)照培養(yǎng)液含相同濃度DMSO。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清（Bioind），DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco），兔抗鼠單克隆 MIF 抗體（chemokine），兔抗鼠 GAPDH抗體（fermentas），羊抗兔 IgG-HRP（fermentas）、預(yù)染蛋白 marker（fermentas），Trizol試劑 （invitrogen），ECL發(fā)光盒 Pierce ECL Western Blotting Substrate （thermo），PrimeScript?RT reagent Kit（Takara），熒光染料 SYBR Green I（ABI）、引物由invitrogen公司合成（見表1）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 奧氮平處理 H9C2細(xì)胞用0.5%血清的培養(yǎng)基饑餓24 h，再加入不同濃度奧氮平培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，取變化最明顯的濃度40 umol為固定濃度，將細(xì)胞培養(yǎng) 1、3、12和 24 h，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置未用奧氮平處理組為對(duì)照組（con），用Trizol收集細(xì)胞并放在－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 氯仿－異丙醇法抽提總mRNA，用752紫外光柵分光光度計(jì)測(cè)定樣本的總RNA純度及濃度后樣本保存于－80℃冰箱備用。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作步驟，合成第1鏈cDNA后凍存于－20℃中備用。

1.2.4 SYBR Green I熒光染料 RT-qPCR 定量檢測(cè) 使用SYBR Green I熒光染料法在384孔ABI Prism 7900 序列檢測(cè)系統(tǒng)（Applied Biosystems，CA）上熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，分析MIF基因表達(dá)。為控制不同樣本間的基因表達(dá)差異，用管家基因3－磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)對(duì)照基因，來(lái)標(biāo)化目的基因的表達(dá)（以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照基因，計(jì)算MIF基因mRNA相對(duì)定量即2－△△CT）。每個(gè)樣本的MIF基因和內(nèi)對(duì)照GAPDH基因均重復(fù)3次。熒光實(shí)時(shí)定量 PCR擴(kuò)增體系共 10 μL：SYBR Green I PCRMastermix5μL，上、下游 Primer計(jì)0.8μL，RNasefree H2O 3.2 μL，cDNA 模板 1 μL。 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 用 2步法，擴(kuò)增條件：95℃ 10 min，95℃ 30s、60℃1 min、72℃1 min、40個(gè)循環(huán)。采用比較循環(huán)數(shù)（cycle threshold，CT）的方法相對(duì)定量［15］。 熒光定量PCR的結(jié)果以CT值顯示，CT值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?！鰿T值＝單樣本平均目標(biāo)基因CT值—單樣本平均GAPDH基因CT值。以2－△△CT代表目的基因的表達(dá)水平（每個(gè)樣本的△△CT＝每個(gè)樣本的平均△CT一對(duì)照組的平均△CT）來(lái)計(jì)算表達(dá)差異的倍數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 用于RT-PCR及qRT-PCR的引物序列

1.2.5 蛋白印跡 冰上提取組織總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量；用5X蛋白loading buffer（LB）將總蛋白配置成含1XLB的蛋白上樣液，在100℃的block中煮沸5 min，室溫下冷卻后凍存于－80℃?zhèn)溆谩Ｅ渲?2%的SDS-PAGE凝膠，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上；5%脫脂奶粉常溫封閉1 h；加入 MIF、GAPDH 一抗（1 ∶2000，1 ∶5000），在 4℃冰箱中孵育過(guò)夜，TBST漂洗10 min×3次，加入二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG）室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次，混均ECL顯影液后在Fuji las3000顯影儀中將免疫復(fù)合物顯影。用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)軟件IMAGE J分析測(cè)定MIF及內(nèi)參照GAPDH，比較MIF的積分光密度比值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用（）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較不同處理組與對(duì)照組間的差異；采用one-way ANOVA方差分析方法，以不同處理方式做為組間因素，比較不同處理對(duì)MIF表達(dá)趨勢(shì)的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn) ɑ＝0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 H9C2細(xì)胞用奧氮平處理后，MIF在mRNA水平表達(dá)升高 H9C2細(xì)胞用奧氮平在不同濃度處理（F ＝ 12.197，P ＝ 0.002）和不同時(shí)間處理（F ＝93.038，P ＜ 0.01） 后，MIF mRNA 的表達(dá)呈顯著升高的變化趨勢(shì)。用不同濃度的奧氮平處理H9C2細(xì)胞24 h，MIF的mRNA表達(dá)水平隨著奧氮平處理濃度的增加而升高；在奧氮平濃度為40 umol時(shí)，MIF表達(dá)量最高（P＜0.01）；當(dāng)固定奧氮平處理濃度時(shí)（40 umol），MIF的mRNA表達(dá)也隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，在處理時(shí)間為24 h時(shí)，MIF的表達(dá)增加最顯著（P＜0.01）。奧氮平誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞MIF的mRNA表達(dá)水平升高，這種升高與奧氮平的濃度及處理時(shí)間存在依賴關(guān)系（見圖1）。

圖1 H9C2細(xì)胞用奧氮平處理后MIF mRNA表達(dá)改變

2.2 H9C2細(xì)胞用奧氮平處理后，MIF在蛋白水平表達(dá)升高 H9C2細(xì)胞用奧氮平在不同濃度處理（F ＝ 10.713，P ＝ 0.004）和不同時(shí)間處理（F ＝56.708，P ＜ 0.01）后，MIF 蛋白的表達(dá)呈顯著升高的變化趨勢(shì)（見圖2）。用奧氮平處理H9C2細(xì)胞24小時(shí)，MIF蛋白表達(dá)水平隨著奧氮平處理濃度的增加而增加，在濃度為40 umol時(shí)，MIF在蛋白的表達(dá)水平最高（P ＜ 0.01，見表 2）；當(dāng)固定奧氮平處理濃度時(shí)為40 umol時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MIF的蛋白表達(dá)也逐漸增加，在處理時(shí)間為24 h時(shí)，MIF的蛋白表達(dá)增加最顯著（P ＜ 0.01，見表 2）。奧氮平處理誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞的MIF在蛋白表達(dá)水平升高，這種升高與奧氮平處理存在濃度與時(shí)間的依賴關(guān)系。

圖2 H9C2細(xì)胞用奧氮平處理后MIF蛋白表達(dá)改變

表2 蛋白印跡的MIF的積分光密度比值 （）

表2 蛋白印跡的MIF的積分光密度比值 （）

1）：與對(duì)照組相比，經(jīng)單因素方差分析方法檢驗(yàn)，P＜0.052）：與對(duì)照組相比，經(jīng)單因素方差分析方法檢驗(yàn)，P＜0.01

組別按濃度分組按處理時(shí)間分組10 umol 20 umol 40 umol 1 h 3 h 12 h 24 h n3333333 MIF的積分光密度比值1.16 ± 0.141.36 ± 0.181）1.50 ± 0.132）1.13 ± 0.081.39 ± 0.981.55 ± 0.951）1.98 ± 0.122）

3 討論

奧氮平的抗精神病作用確切，神經(jīng)系統(tǒng)副作用較少，臨床應(yīng)用日益廣泛，由于部分患者用藥出現(xiàn)的代謝紊亂及CVD風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響了患者對(duì)該藥的依從性，制約了其臨床使用。臨床研究顯示精神分裂癥患者較正常人的預(yù)期壽命縮短20%，而2／3以上的患者死于冠心?。ㄕＨ巳簽?1 ／2）［11］。一項(xiàng)包括18個(gè)研究的Meta分析表明CVD是精神分裂癥患者的主要死亡原因［3］。臨床也反復(fù)證實(shí)SGA可誘發(fā)嚴(yán)重的CVD。但SGA誘發(fā)CVD的機(jī)制目前尚不清楚。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為CVD是SGA誘發(fā)代謝障礙的后果，SGA通過(guò)拮抗中樞組胺、5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)增加代謝障礙易感性，加劇肥胖、糖尿病、高脂血癥的發(fā)生，從而增加CVD的風(fēng)險(xiǎn)。然而，臨床上有部分患者在沒有代謝障礙的情況下仍然發(fā)生CVD，因此，還存在傳統(tǒng)觀點(diǎn)無(wú)法解釋的SGA致CVD機(jī)制。

MIF作為一種多效的細(xì)胞因子，在免疫、炎癥、代謝、損傷修復(fù)等病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)MIF在CVD中有重要作用，臨床研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化、急性心肌梗死、冠心病等患者血清高M(jìn)IF水平［12］；動(dòng)物研究也發(fā)現(xiàn)MIF在動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的血管平滑肌中也表達(dá)升高［13］。在MIF基因敲除的動(dòng)物模型中不易誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，以上研究從多個(gè)層面揭示了MIF與CVD之間的聯(lián)系。但其深層次的機(jī)制目前尚不清楚，目前MIF在心臟損傷中的作用結(jié)論相互矛盾，有研究認(rèn)為MIF對(duì)心肌具有損傷作用，如在正常情況下，培養(yǎng)基中少量的MIF可以引起心肌調(diào)亡，MIF可能通過(guò)加速心肌的凋亡導(dǎo)致心衰［14］。MIF敲除小鼠炎癥反應(yīng)降低，從而減少了心肌缺血再灌注損傷［15］，提示MIF可能參與心肌缺血再灌注損傷。但也有研究認(rèn)為MIF升高后活化磷酸腺苷激活蛋白激酶AMPK而對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用［16］或通過(guò)減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)保護(hù)心臟缺血再灌注損傷［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)，用奧氮平處理大鼠心肌細(xì)胞H9C2用后，MIF表達(dá)在mRNA與蛋白水平均升高，且MIF的表達(dá)變化與奧氮平處理的濃度和處理的時(shí)間存在數(shù)量依賴關(guān)系，提示奧氮平可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌MIF，推測(cè)MIF在奧氮平誘發(fā)的CVD中可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，但作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。因此，本研究存在一定的缺陷，本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)奧氮平處理心肌細(xì)胞后MIF表達(dá)升高這一現(xiàn)象，推測(cè)MIF可能參與奧氮平誘導(dǎo)的心肌損傷。而MIF升高在奧氮平誘導(dǎo)CVD中起何種作用、機(jī)制如何尚未研究。此外，細(xì)胞研究是一個(gè)獨(dú)立微觀水平的研究，其結(jié)果能否在動(dòng)物水平及人體水平研究中重現(xiàn)，仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。雖然本研究尚存在以上不足，但發(fā)現(xiàn)奧氮平在心肌細(xì)胞模型上可以誘導(dǎo)MIF的高表達(dá)，據(jù)我們所知，目前尚無(wú)這方面的報(bào)道，本研究結(jié)果為今后深入研究奧氮平誘導(dǎo)的CVD的機(jī)制提供了部分依據(jù)。

［1］Ananth J，Parameswaran S，Gunatilake S.Side effects of atypical antipsychotic drugs［J］.Curr Pharm Des，2004，10（18）：2219－2229.

［2］Newcomer JW.Second-generation （atypical） antipsychotics and metaboliceffects： acomprehensiveliteraturereview［J］.CNSDrugs，2005，19 （Suppl 1）：1－93.

［3］Sernyak MJ，Gulanski B，Rosenheck R.Undiagnosed hyperglycemia in patients treated with atypical antipsychotics［J］.J Clin Psychiatry，2005，66（11）：1463－1467.

［4］Hennekens CH，Hennekens AR，Hollar D，et al.Schizophrenia and increased risks of cardiovascular disease［J］.Am Heart J.2005，150（6）：1115－1121.

［5］Ray WA，Chung CP，Murray KT，et al.Atypical antipsychotic drugs and the risk of sudden cardiac death［J］.N Engl J Med.2009，360（3）：225－235.

［6］Haddad PM，Andersen IM.Antipsychotic-related QTc prolongation，Torsadedepointesandsuddendeath［J］.Drugs，2002，62 （11）：1649－1671.

［7］談艷，張少平，陳銀娣.抗抑郁藥和抗精神病藥物所致QT間期延長(zhǎng)和尖端扭轉(zhuǎn)型室速［J］.中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2004，30（5）：附 3－5.

［8］Zernecke A，Bernhgen J，Weber C.Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease ［J］.Circulation，2008，117（12）：1594－1602.

［9］Herder C，Illig T，Baumert J，et al.Macrophage migration inhibitory factor（MIF） and risk for coronary heart disease： results from the MONICA／KORA Augsburg case-cohort study，1984 －2002［J］.Atherosclerosis，2008，200（2）：380－388.

［10］Schober A，Bernhagen J，Thiele M，et al.Stabilization of atherosclerotic plaques by blockade of macrophage migration inhibitory factor after vascular injury in apolipoprotein E-deficient mice［J］.Circulation，2004，109（3）：380－385.

［11］Lieberman JA，Stroup TS，McEvoy JP，et al.Effectiveness of antipsychotic drugs in patients with chronic schizophrenia［J］.N Engl Med，2005，353（12）：1209－1223.

［12］Tereshchenko IP，Petrkova J，Mrazek F，et al.The macrophage migration inhibitory factor （MIF） gene polymorphism in Czech and Russian patients with myocardial infarction［J］.Clin Chim Acta，2009，402（1－2）：199－202.

［13］Lin SG，Yu XY，Chen YX，et al.De novo expression of macrophage migration inhibitory factor in different stages of human atherosclerosis［J］.Circulation，2002，105：1561－1566.

［14］Dhanantwari P，Nadaraj S，Kenessey A，et al.Macrophage migration inhibitory factor induces cardiomyocyte apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，371（2）：298－303.

［15］Gao XM，Liu Y，White D，et al.Deletion of macrophage migration inhibitory factor protects the heart from severe ischemiareperfusion injury： a predominant role of anti-inflammation［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，50（6）：991－999.

［16］Jian Z，Li JB，Ma RY，et al.Increase of macrophage migration inhibitory factor（MIF） expression in cardiomyocytes during chronic hypoxia［J］.Clin Chim Acta，2009，405（1－2）：132－138.

［17］Koga K，Kenessey A，Powell SR，et al.Macrophage migration inhibitory factor provides Cardio-protection during ischemia／reperfusion by reducing oxidative stress［J］.Antioxid Redox Signal，2011，14（7）：1191－202.