氯離子通道ClC－2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

許哲男，鄭向宇，趙 維，辛 華，韓振國(guó)＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胸外科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 病理生理教研室）

氯通道是分布于細(xì)胞膜上對(duì)氯離子或其他陰離子有通透性的電壓門控氯通道（voltage－gated Cl channel，ClC），哺乳動(dòng)物共有9個(gè)亞型，廣泛存在于機(jī)體的細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜，參與細(xì)胞的多種活動(dòng)和功能調(diào)節(jié)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中都存在ClC－2蛋白的過(guò)度表達(dá)和處于磷酸化狀態(tài)。本研究以非小細(xì)胞肺癌為研究對(duì)象，與正常肺組織作為對(duì)比，探討氯離子同通道ClC－2在非小細(xì)胞肺癌及肺部疾病中表達(dá)情況，亦探明氯離子通道ClC－2作為治療非小細(xì)胞肺癌的基因靶位提供有利的依據(jù)，為治療該腫瘤提供新的理論根據(jù)及途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)分組 正常肺組織為對(duì)照組，肺鱗癌、肺腺癌、肺良性病灶為實(shí)驗(yàn)組。肺良性病灶以肺結(jié)核為主，部分為肺大泡和炎性假瘤。組織標(biāo)本購(gòu)于吉林大學(xué)組織標(biāo)本庫(kù)，均收集于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科2008.05－2009.08經(jīng)手術(shù)切除后保存的新鮮冷凍組織，提供標(biāo)本的患者術(shù)前未經(jīng)放、化療等系統(tǒng)抗癌治療。

1.1.2 試劑 總RNA提取Trizol試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司，PCR試劑購(gòu)自TaKara公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒，核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)品，Taq酶，人ClC－2抗體（購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司）為一抗，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的人抗體為二抗，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，M－MuLV RT、5XBuffer，M－MuLV RT Oligo d（T）Primers、購(gòu)自（寶生物，日本），免疫組化超敏Ultrasensitive S－P試劑盒和DAB顯示試劑盒（福州邁新公司），所有抗體均為即用型。

1.1.3 設(shè)備 低溫高速離心機(jī)（久保田，日本），722分光光度計(jì)（上海儀器廠），PCR儀（TAKARA，日本），全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon，中國(guó)），電泳儀（Bio－rad，美國(guó)），蛋白質(zhì)電泳裝置及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（BioBrad，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR 檢測(cè)ClC－2mRNA的表達(dá) 應(yīng)用Trizol試劑盒，按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)對(duì)肺鱗癌及腺癌；肺良性病灶，正常肺組織分別提取總RNA。以上述所得總RNA為模板、Oligo（dT）為mRNA引物，應(yīng)用SuperScriptⅡ試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，用人ClC－2特異性引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR特意擴(kuò)增，詳細(xì)操作步驟參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。ClC－2引物序列

forward5′－AGGCTTCTGTCTGCTTCCA－3′；Reverse5′－TTCCAATGAGTCTGCCAATAC－3′。擴(kuò)增的產(chǎn)物cDNA3′端大小約477bp。獲得RTPCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗(yàn)，用以上的方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

1.2.2 Western blot檢測(cè)ClC－2蛋白的表達(dá) 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用凝膠成像系統(tǒng)攝像，軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR

利用ClC－2特意引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在與DL2000DNA marker對(duì)應(yīng)的250－500bp之間非小細(xì)胞肺癌組有一明顯特異片段，肺良性病和正常肺組中其顯示微弱，再與每個(gè)樣品測(cè)得的目的基因含量與本樣品的GAPDH含量相除，得到每個(gè)樣品目的基因的相對(duì)含量，然后才進(jìn)行樣品與樣品之間的比較。結(jié)果表明非小細(xì)胞肺癌ClC－2基因表達(dá)量明顯增加（見(jiàn)圖1）。

圖1 RT－PCR檢測(cè)ClC－2及GAPDH的電泳結(jié)果

2.2 Western Blot

檢測(cè)結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌組中ClC－2蛋白在98KD出有一條明顯特征帶，ClC－2／β－Actin趨勢(shì)比較，表明非小細(xì)胞肺癌中鱗癌表達(dá)量最高，其次肺腺癌及良性病灶表達(dá)無(wú)明顯差距，相比正常肺組織中ClC－2蛋白表達(dá)量比實(shí)驗(yàn)組降低，每組中氯離子通道ClC－2均有一定的表達(dá)（見(jiàn)圖2）。

圖2 Westemblot檢測(cè)ClC－2蛋白的表達(dá)

3 討論

ClC屬電壓門控性通道（voltage－gated chloride channels，ClC），在細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)、細(xì)胞電位、細(xì)胞器的酸化及pH的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，免疫細(xì)胞的募集及激活等多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1，2］，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)電壓門控性氯離子通道在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，且可能在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、演化、增殖、細(xì)胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性等惡性生物學(xué)行為中可能起重要作用［3，4］。

ClC－2是ClC的一員，其分布廣泛，在大腦，腎臟及腸道的表達(dá)相對(duì)較高［5］。ClC通道家族成員的蛋白質(zhì)功能性結(jié)構(gòu)分析表明［6］，ClC通道蛋白質(zhì)可能形成二聚體，具有“雙筒槍（double－b－arreled）”通道結(jié)構(gòu)?；蛲蛔兯斐蒀lC型氯離子通道蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常，尤其是涉及功能的活性位點(diǎn)發(fā)生變化，是影響ClC型氯離子通道生理功能并發(fā)疾病的一個(gè)主要原因，例如CBS區(qū)域內(nèi)（真核生物ClC蛋白中還有兩個(gè)β－胱硫醚合酶）的點(diǎn)突變會(huì)影響通道的電壓依賴性及ATP結(jié)合，導(dǎo)致一些遺傳性疾病［7，8］，另外ClC型氯離子通道的基因缺陷或表達(dá)異常也會(huì)引起相應(yīng)的生理變化或疾病。

電壓門控性氯離子通道影響生物學(xué)行為的機(jī)制可能如下：（1）調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，運(yùn)用氯離子通道阻滯劑作用癌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞周期停滯于G0／G1，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度下降，這可能表明氯離子通道調(diào)節(jié)鈣離子濃度，從而間接影響癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期［9］。（2）磷酸化調(diào)節(jié)cAMP依賴的激酶（PKA）和蛋白激酶C（PKC），可以刺激或抑制ClC－2的活性，活體外的磷酸化測(cè)定顯示ClC－2可以被M時(shí)相特異同期蛋白依賴性激酶p34cdc2／細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白B（M－phase－specificcyclin－dependent kinase p34cdc2／cyclinB）磷 酸化［10］，顯著降低 ClC－2電流。因此 ClC－2第632位絲氨酸－丙氨酸（S632A）突變消除了ClC－2的磷酸化位點(diǎn)，從而消除了p34cdc2／cyclinB對(duì)其功能的調(diào)節(jié)作用。（3）細(xì)胞體積調(diào)控機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞處在一個(gè)低滲環(huán)境時(shí)，水的被動(dòng)流動(dòng)引起細(xì)胞腫脹后水和離子外流，細(xì)胞的體積得以恢復(fù)，此過(guò)程稱為細(xì)胞調(diào)節(jié)性體積下降（regulatory volume decrease，RVD），癌細(xì)胞在侵襲遷移過(guò)程中需要體積下降以“擠”過(guò)狹小的組織間隙。調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積回縮（RVD），認(rèn)為是當(dāng)細(xì)胞暴露與低滲環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膨脹，該膨脹會(huì)激活細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制，使已增大的細(xì)胞容積減小并向正常體積轉(zhuǎn)變。RVD被認(rèn)為是細(xì)胞增殖、分化、遷移及細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)的生理功能之一。研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌發(fā)生中，氯通道通過(guò)RVD參與了細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移［11，12］。Soroceanu等分別證實(shí)，氯通道阻斷劑能夠抑制腫瘤的侵襲。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)序貫，復(fù)雜的過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶、黏附基底膜和細(xì)胞基質(zhì)，并對(duì)其水解破壞，癌細(xì)胞侵入周圍脈管，繼續(xù)生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)移癌，貫穿于整個(gè)過(guò)程，肺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)可視為一個(gè)“主動(dòng)”運(yùn)動(dòng)過(guò)程，通過(guò)癌細(xì)胞容積和形狀的改變，具有浸潤(rùn)潛能的癌細(xì)胞來(lái)完成浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。有研究證實(shí)低滲環(huán)境下，腺癌細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)容積的部分恢復(fù)，而鱗癌細(xì)胞可調(diào)節(jié)細(xì)胞回復(fù)原有的或甚至更小的容積，表明與正常肺組織相比，肺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的機(jī)制來(lái)控制細(xì)胞大小以保持其旺盛的生存能力，進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生快速變形以增加其分裂增殖及浸潤(rùn)潛能。

本實(shí)驗(yàn)采用RT－PCR法和 Western blot法分別在基因和蛋白水平檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌、肺良性病及正常肺組織中ClC－2mRNA及ClC－2通道蛋白的表達(dá)程度，結(jié)果顯示ClC－2基因產(chǎn)物為非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)量明顯高于肺良性病及正常肺組織，提示ClC－2可能與肺癌癌變的原始發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中起到基因調(diào)控作用，與腫瘤發(fā)生、促進(jìn)增長(zhǎng)及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。ClC－2mRNA特異性表達(dá)升高在基因水平上賦予了肺癌細(xì)胞較強(qiáng)的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力，有利于細(xì)胞大小和形狀的改變，從而導(dǎo)致瘤細(xì)胞易于分裂和侵襲轉(zhuǎn)移。然而蛋白表達(dá)水平上肺良、惡性腫瘤與正常肺組織相比有明顯表達(dá)增加，但良、惡性疾病之間無(wú)顯著差異。這可能提示氯通道作為電壓門控離子通道，廣泛分布于人體的細(xì)胞器及細(xì)胞器膜，調(diào)節(jié)細(xì)胞體積。在肺部疾病發(fā)展過(guò)程中正常細(xì)胞向疾病轉(zhuǎn)變，一系列遺傳信息的改變可能會(huì)影響ClC－2蛋白的表達(dá)，或ClC－2蛋白的活性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致無(wú)論是非小細(xì)胞肺癌，還是肺良性疾病，均會(huì)增加ClC－2蛋白表達(dá)量。

但ClC－2mNRA及ClC－2蛋白在正常組織和肺部良、惡性疾病中的表達(dá)差異及發(fā)生變異的ClC－2離子通道基因作用于肺惡性腫瘤生成，進(jìn)展的哪個(gè)階段等一系列問(wèn)題必將會(huì)今后研究的重要方向。ClC－2也將成為非小細(xì)胞肺癌及肺部疾病診的斷與治療提供新的基因靶位，對(duì)此，還需要進(jìn)一步研究。

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