星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化依托貝特緩釋膠囊的制備

曹升，張朝暉，吳小濤，何紅燕，霍苙茹

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.南京長(zhǎng)澳醫(yī)藥科技有限公司，江蘇南京210038)

依托貝特為氯貝酸［2-(對(duì)-氯苯氧基)-2-甲基丙酸2-(煙酰氧基)乙酯］與煙酸通過(guò)化學(xué)鍵連接(化學(xué)合成)所形成的前體藥物，是一種復(fù)合酯類物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)自身酶系的代謝分解作用重新還原為氯貝酸和煙酸而發(fā)揮降脂療效。Roberto［1］通過(guò)專利報(bào)道了一種制備依托貝特緩釋膠囊的方法，但緩釋效果較差，8 h的累積釋放度超過(guò)90%。本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法對(duì)依托貝特緩釋膠囊的處方進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與試藥

U-3000高效液相色譜儀(德國(guó)戴安公司);DIKMA色譜柱(150 mm×4.6 mm，迪馬公司);Chromeleon工作站(德國(guó)戴安公司);AL204電子天平(梅特勒托利多父子公司);BLL360包衣造粒機(jī)(北京運(yùn)載火箭技術(shù)研究院);BT00-100M蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司);ZRS-8G智能溶出儀(天津大學(xué)無(wú)線電廠);依托貝特對(duì)照品(南京長(zhǎng)澳醫(yī)藥科技有限公司，純度99.3%，批號(hào)20100903);依托貝特原料藥(南京長(zhǎng)澳醫(yī)藥科技有限公司，純度98.7%，批號(hào)20100402);丙酮(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20110620);PEG4000(汕頭市西隴化工有限公司，批號(hào)090315);Eudragit?RL30D(B09110523)乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 依托貝特緩釋膠囊的制備

將過(guò)60目篩的原料加入包衣造粒機(jī)的供粉料斗中，主機(jī)轉(zhuǎn)速為200 r/min，供粉速度為50 r/min，鼓風(fēng)流量為15×20 L/min，噴氣壓力為0.5 MPa，以丙酮為黏合劑，噴漿泵轉(zhuǎn)速為20 r/min制備丸心，將制得的小丸置于30℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥6 h，直至丙酮完全揮發(fā)。干燥后的微丸先后過(guò)18和45目篩，得依托貝特母丸，收率為78.5%。

取上述母丸置于包衣造粒鍋中，主機(jī)轉(zhuǎn)速100 r/min，35℃預(yù)熱30 min。將與丸心質(zhì)量相當(dāng)?shù)囊劳胸愄厝苡诒芤褐?，并加入熔融后的PEG4000攪拌使其溶于上述溶液中，作為包衣液對(duì)母丸進(jìn)行包衣。

包衣后的小丸置于30℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥30 min。將一定量的滑石粉，檸檬酸三乙酯加入丙烯酸樹(shù)脂水分散體溶液(Eudragit?RL30D)中分散均勻，對(duì)上述包衣小丸進(jìn)行緩釋層包衣。包衣結(jié)束后于30℃干燥30 min。

2.2 體外累積釋放度的測(cè)定

2.2.1 HPLC 分析方法的建立

2.2.1.1 色譜條件 色譜柱:U-3000高效液相色譜儀;DIKMA色譜柱(150 mm×4.6 mm)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以10 mmol/L的磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.1)-乙腈(50∶50)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為221 nm;流速為1.5 ml/min。進(jìn)樣量 20 μl。

2.2.1.2 專屬性考察 取依托貝特緩釋膠囊1粒，研成粉末，取約20 mg精密稱定，加入100 ml容量瓶中，加入5 ml甲醇溶解，并用流動(dòng)相定容至刻度。同時(shí)取對(duì)照品20 mg相同條件下配制溶液，在“2.2.1.1”的色譜條件下分別進(jìn)樣，記錄各色譜峰的保留時(shí)間。結(jié)果依托貝特保留時(shí)間為9.967 min，陰性對(duì)照未出峰，可見(jiàn)輔料無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)圖譜Fig 1 Specialty chromatography spectrum

2.2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取預(yù)先配置好的依托貝特溶液(7.5 mg/ml)1，2，4，6，8 ml，置于 100 ml容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，濾過(guò)。精密移取20 μl注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定依托貝特色譜峰面積，依托貝特濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=20 262.81X+6.058(r=0.9998)。結(jié)果表明，依托貝特檢測(cè)濃度線性范圍為0.075～0.6 mg/ml。

2.2.1.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述樣品溶液(7.5 mg/ml)，于室溫下放置，分別在 0，2，4，6，8，12，24 h后，作適當(dāng)稀釋，精密量取20 μl進(jìn)樣，結(jié)果依托貝特樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)的峰面積RSD=2.37%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.1.5 回收率試驗(yàn) 按本品規(guī)格的 80%，100%，120%(放大50倍)，分別精密稱取依托貝特原料適量，按處方比例與相應(yīng)的輔料混合，分別精密稱取適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成含依托貝特高、中、低3種濃度的溶液(各3份)，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.7%，RSD為0.48%。結(jié)果表明該方法回收率好，能達(dá)到測(cè)定要求。

2.2.2 累積釋放度實(shí)驗(yàn) 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)可知除pH1.2鹽酸外，其他水性介質(zhì)不加表面活性劑均不能達(dá)到漏槽條件，加入表面活性劑的各水性釋放介質(zhì)中藥物釋放呈現(xiàn)pH非依賴性，而水作為釋放介質(zhì)最具代表性，因此以0.5%SDS水溶液900 ml為溶出介質(zhì)，采用籃法的裝置，轉(zhuǎn)速為100 r/min，在4，8，24 h取樣2 ml，濾過(guò)，適當(dāng)稀釋后作為供試品溶液。每次取樣后立即補(bǔ)充同體積2 ml的溶出介質(zhì)。進(jìn)樣量20 μl，按外標(biāo)法代入標(biāo)曲計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放度。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)依托貝特緩釋膠囊累積釋放度影響較顯著的3個(gè)因素作為考察對(duì)象，即增溶層與丸心比例(X1)、增溶層中PEG4000用量(X2)、緩釋層增重百分率(X3)。綜合選擇各因素的水平(表1)，以依托貝特緩釋膠囊在4，8和24 h的累積釋放度(分別用 Q4h，Q8h，Q24h表示)為考察指標(biāo)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平表Tab 1 Factors and levels

表2 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列和長(zhǎng)度Tab 2 Primers sequence and length of the experiment

2.4 模型擬合與效應(yīng)面優(yōu)化

應(yīng)用Design-Expert軟件，以評(píng)價(jià)指標(biāo)(因變量)分別對(duì)各因素(自變量)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合。對(duì)二項(xiàng)式方程中的各項(xiàng)式系數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，為精簡(jiǎn)模型，刪除P＞0.2的項(xiàng)。

所得多元線性回歸方程如下:

所得二項(xiàng)式方程如下:

由相關(guān)系數(shù)可見(jiàn)，均采用二項(xiàng)式方程擬合較好，二項(xiàng)式方程擬合的置信度明顯優(yōu)于多元線性方程。

根據(jù)二項(xiàng)式擬合方程，應(yīng)用Design-Expert軟件分別繪制各指標(biāo)與影響因素的三維效應(yīng)面，見(jiàn)圖2、圖3和圖4。

圖2 Q4h與X1、X2、X3的三維效應(yīng)面和二維等高圖Fig 2 Effect of X1、X2、X3values on Q4hwith 3D surface plot and 2D contour plot

圖3 Q8h與X1、X2、X3的三維效應(yīng)面和二維等高圖Fig 3 Effect of X1、X2、X3values on Q8hwith 3D surface plot and 2D contour plot

圖4 Q24h與X1、X2、X3的三維效應(yīng)面和二維等高圖Fig 4 Effect of X1、X2、X3values on Q24hwith 3D surface plot and 2D contour plot

由圖2～4可見(jiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨X1，X2的增大，Q4h，Q8h，Q24h均呈上升趨勢(shì);隨著 X3的增大，Q4h，Q8h，Q24h呈下降趨勢(shì)，且 X1較小，X2較大時(shí)下降較為明顯，反之則下降較為平緩。如假定緩釋膠囊的目標(biāo)釋放度Q4h為20% ～30%，Q8h為40% ～60%，Q24h為70% ～90%。通過(guò)繪制效應(yīng)面圖，得同時(shí)滿足上述條件的區(qū)域即各因素的優(yōu)化區(qū)域:增溶層與丸心質(zhì)量比為0.7～1.2，PEG4000占增溶層比例為3.5% ～12.8%，緩釋層包衣增重8.0% ～13.5%。

2.6 優(yōu)化處方驗(yàn)證

綜合分析上述結(jié)果，得最佳處方參數(shù)為X1=1 ∶1，X2=8.3%，X3=10.5%。依該處方制備樣品，按2.2項(xiàng)下所述方法測(cè)定優(yōu)化后處方制備的樣品與按原處方(專利公開(kāi)處方)制備的樣品的體外累積釋放度，繪制累積釋放度曲線如圖5。比較4，8，24 h優(yōu)化處方各指標(biāo)的模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值，以公式“偏差=(預(yù)測(cè)值－實(shí)際值)/預(yù)測(cè)值×100%”計(jì)算偏差，結(jié)果偏差的絕對(duì)值小于5%，證明所見(jiàn)模型具有良好的預(yù)測(cè)能力。

圖5 優(yōu)化處方與原處方累積釋放曲線Fig 5 In vitro cumulated release curve of optimized formulation and original formulation

由圖5可見(jiàn)，與原處方相比，優(yōu)化后的處方依托貝特在24 h內(nèi)緩慢持久釋放，具有明顯的緩釋效果。

3 討論

依托貝特為水難溶性藥物，采用母丸上包一層增溶層的方法可增加其在水中的溶解度并加快其溶解速度。水難溶性藥物增溶一般采用制成固體分散體的方法，即藥物與一種生理?xiàng)l件下顯惰性、易溶于水的固體載體以熔融、溶劑或溶劑-熔融相結(jié)合的方法制成藥物在固體載體中高度分散的體系［2］。依托貝特的緩釋制劑處方中主藥比例較大，將主藥與PEG4000作為致孔劑同時(shí)溶于丙酮中，通過(guò)包衣可以加速依托貝特在水中的溶出速率。

離心造粒法制備的該依托貝特小丸為骨架型小丸，可能的溶出機(jī)制為溶蝕機(jī)制輔以擴(kuò)散機(jī)制，通過(guò)在溶液中不斷溶蝕并擴(kuò)散至溶液中，溶出速率隨小丸與介質(zhì)接觸的表面積的減小而減小，因此經(jīng)12 h后溶出速率顯著減慢。Eudragit?RL30D聚合物對(duì)pH不敏感，可對(duì)顆粒、微丸或片劑進(jìn)行包衣，用于制備釋藥速率不受胃腸道消化液影響的緩釋制劑［3］。藥物通過(guò)樹(shù)脂聚合物包衣膜的擴(kuò)散和滲透進(jìn)入介質(zhì)，微丸的包衣膜保持完整，擴(kuò)散和滲透的速率不受介質(zhì)pH的影響，包衣膜水化產(chǎn)生膨脹現(xiàn)象。通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案驗(yàn)證制備的緩釋膠囊能夠?qū)崿F(xiàn)在24 h內(nèi)緩慢穩(wěn)定釋放。有文獻(xiàn)報(bào)道緩釋制劑與同劑量速釋制劑生物利用度無(wú)明顯差異［4］，但緩釋制劑可使患者血藥濃度更加平穩(wěn)，并能減少給藥次數(shù)，提高患者的順應(yīng)性。

［1］Roberto V.Process for preparing etofibrate or similar compounds containing sustained release microgranules and products thus obtained:US 957746［P］.1990 －09 －18.

［2］楊碩曄，郭允，陳西敬.制劑新技術(shù)在水難溶性藥物中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥房，2011，22(13):1228－1231.

［3］白靖，李騫，王靜，等.藥用丙烯酸樹(shù)脂在制劑中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)藥房，2011，22(17):1614－1617.

［4］Johnson K，Hoppe HJ，Schatton W.Relative bioavailability of etofibrate.A comparison of an acute and a new sustained release formulation［J］.Arzneimittelforschung，1984，34(12):1785 －1787.