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    七厘散促小鼠觸須部創(chuàng)面修復(fù)及部分機(jī)制探討*

    2012-11-22 01:08:46劉愛(ài)軍杜標(biāo)炎廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院廣州510006
    陜西中醫(yī) 2012年4期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)服外用纖維細(xì)胞

    劉愛(ài)軍 易 華 杜標(biāo)炎 廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(廣州510006)

    皮膚覆蓋在人體表面,日常生活中極易發(fā)生創(chuàng)傷。中醫(yī)中藥治療皮膚損傷歷史悠久,療效確切。七厘散(Qili San)是著名的傷科要藥,至今仍在臨床廣為應(yīng)用,但是由于中藥中成分復(fù)雜,其促進(jìn)皮膚愈合的機(jī)制目前尚未完全明了,本文主要研究七厘散在小鼠觸須部皮膚缺損修復(fù)中的作用,并初步探討了七厘散含藥血清對(duì)皮膚成纖維的促增殖作用,為進(jìn)一步研究七厘散促進(jìn)皮膚干細(xì)胞的增殖和分化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明小鼠,出生后約4w,質(zhì)量20~25g,購(gòu)自本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(質(zhì)量合格證編號(hào):SCXK(粵)2008-0020)。

    1.2 主要試劑 七厘散購(gòu)自北京同仁堂制藥廠,批號(hào):0100006;無(wú)菌生理鹽水、醫(yī)用酒精、無(wú)菌棉簽均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)保健科;外用噴劑金因肽購(gòu)自廣州紅十字會(huì)醫(yī)院,產(chǎn)品批號(hào):2009-08-08,含表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)2000IU/mL;梯度酒精、二甲苯、HE染料、中性樹(shù)膠均為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院技術(shù)室提供。高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(FBS,天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆?5cm2塑料培養(yǎng)瓶(Coning公司);胰蛋白酶(Sigma公司),余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 德國(guó)TP1020組織脫水機(jī);德國(guó)EG1160石蠟包埋機(jī);德國(guó)LeicaRM2135輪轉(zhuǎn)切片機(jī);德國(guó)HI1220攤片機(jī);德國(guó)ET4040染色機(jī);防脫玻片及蓋玻片購(gòu)自博士德生物試劑公司;日本OLYMPUS光學(xué)顯微鏡。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法 1.4.1 七厘散促小鼠觸須部皮膚修復(fù)的作用:無(wú)菌條件下剪去昆明雄小鼠雙側(cè)觸須部表皮,保留真皮,隨機(jī)分為5組,每組20只,分別進(jìn)行以下處理:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組創(chuàng)面涂以生理鹽水;陽(yáng)性藥物對(duì)照組以金因肽均勻噴濕創(chuàng)面,約4000IU/mL×10cm2;七厘散內(nèi)服組以120mg/mL七厘散混懸液、按0.2mL/10g灌胃,七厘散外用組以20%龍血竭混懸液、按24mg/cm2涂于觸須部創(chuàng)面;七厘散內(nèi)服+外用組以上述內(nèi)服、外用劑量同時(shí)應(yīng)用,以上各組每日定時(shí)處理1次,連續(xù)觀察各組動(dòng)物7d創(chuàng)面愈合情況。術(shù)后1d、3d、5d、7d取觸須創(chuàng)面,每組每次5只小鼠,行常規(guī)病理學(xué)組織切片,HE染色,片厚2μm,顯微鏡下觀察各組標(biāo)本改變。

    1.4.2 七厘散含藥血清的制備:雄性昆明小鼠,質(zhì)量20~25g,七厘散劑量為等效劑量的20倍,無(wú)菌生理鹽水混勻,每天灌胃2次,間隔12h,連續(xù)7d,第8日禁食不禁水,上午灌胃2次,間隔2h,于末次灌胃后1h斷頭取血,所取全血室溫下靜置2~3h,3000r/min離心10min,分離血清,將所有血清混合;56℃、30min滅活;0.2μm 濾膜過(guò)濾除菌;-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.3 小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng):孕齡12.5d~14.5d昆明小鼠處死后,無(wú)菌條件下取出胚胎,去除胚胎頭、四肢和內(nèi)臟,剪碎軀干部分組織,加入2.5g/L胰蛋白酶消化1min,用含血清的培養(yǎng)基中止消化,離心,棄上清,用培養(yǎng)基重新懸浮組織,將組織接種入25cm2培養(yǎng)瓶,5%CO2、37℃靜置培養(yǎng),4~6d原代細(xì)胞長(zhǎng)滿,常規(guī)消化傳代,調(diào)整P3代細(xì)胞濃度,以8000個(gè)/孔接種于96孔板,細(xì)胞饑餓24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.4.4 MTT法檢測(cè)七厘散含藥血清對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響:高糖DMEM含總血清20%,其中含七厘散含藥血清分別為0%、2.5%、5%、10%、20%五個(gè)濃度梯度,余血清以胎牛血清補(bǔ)足血清總體積為20%,用作用于96孔板中培養(yǎng)的胎鼠皮膚成纖維細(xì)胞,24h后MTT法檢測(cè)不同條件下胎鼠皮膚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,無(wú)血清DMEM作為空白對(duì)照,尋找能顯著促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的七厘散含藥血清體積百分比。

    2 結(jié) 果 2.1 各組動(dòng)物創(chuàng)面大體觀察 術(shù)后1d,七厘散內(nèi)服+外用組各組動(dòng)物創(chuàng)面無(wú)出血,呈暗紅色,約有一半出現(xiàn)結(jié)痂,其余各組動(dòng)物創(chuàng)面無(wú)出血,呈暗紅色,無(wú)結(jié)痂。術(shù)后2d,陽(yáng)性藥物對(duì)照組、七厘散內(nèi)服+外用組已全部結(jié)痂;其余各組亦出現(xiàn)結(jié)痂。術(shù)后3d,除實(shí)驗(yàn)對(duì)照組外其余各組動(dòng)物創(chuàng)面全部結(jié)痂。術(shù)后5d,陽(yáng)性藥物對(duì)照組、七厘散內(nèi)服+外用組已出現(xiàn)痂皮脫落,新生表皮平滑、有光澤、色淡。術(shù)后6d,其余各組開(kāi)始痂皮脫落。術(shù)后7d,各組小鼠觸須部創(chuàng)面基本痊愈。

    2.2 各組動(dòng)物創(chuàng)面病理學(xué)改變 術(shù)后1d,各組鏡下可見(jiàn)大量滲出紅細(xì)胞、炎細(xì)胞(圖1),七厘散內(nèi)服+外用組紅細(xì)胞滲出少,炎性反應(yīng)較輕(圖2)。術(shù)后3d,各組動(dòng)物創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均減少(圖3);七厘散內(nèi)服+外用組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組創(chuàng)面可見(jiàn)有表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增生(圖4)。術(shù)后5d,各組可見(jiàn)表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增生,表皮細(xì)胞和膠原纖維排列疏松紊亂(圖5),七厘散內(nèi)服+外用組成纖維細(xì)胞增生明顯,膠原纖維合成和分泌增加,真皮層較致密,新生表皮較厚,細(xì)胞分層明顯(圖6)。術(shù)后7d,創(chuàng)面基本修復(fù),七厘散內(nèi)服+外用組表皮細(xì)胞分層明顯,真皮致密,表皮-真皮連接緊密(圖7),其余各組表皮-真皮連接有局部不牢固(圖8)。

    圖1 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后1d,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,滲出紅細(xì)胞較多HE染色 ×400

    圖2 七厘散內(nèi)服+外用組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后1d,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少,滲出紅細(xì)胞少 HE染色 ×400

    圖3 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后3d,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少HE染色 ×400

    圖4 七厘散內(nèi)服+外用組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后3d,創(chuàng)面表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞開(kāi)始增生 HE染色 ×400

    圖5 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后5d,表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增生,膠原纖維排列疏松紊亂 HE染色 ×400

    圖6 七厘散內(nèi)服+外用組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后5d,新生表皮明顯,成纖維細(xì)胞、膠原纖維增多 HE染色 ×400

    圖7 七厘散內(nèi)服+外用組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后7d,新生表皮明顯,真皮致密,表皮-真皮連接緊密 HE染色 ×400

    圖8 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠觸須部創(chuàng)面術(shù)后7d,新生表皮-真皮局部連接欠佳 HE染色× 400

    2.3 MTT測(cè)定七厘散含藥血清對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響

    圖9 七厘散含藥血清對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響104個(gè)/孔

    討 論 皮膚位于身體表面,直接與外界環(huán)境相接觸,皮膚創(chuàng)傷是臨床上的常見(jiàn)病與多發(fā)病,如何快速有效地促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合、防止各種嚴(yán)重并發(fā)癥有著重要的臨床意義。

    祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為皮膚創(chuàng)傷后創(chuàng)面形成血瘀證[1],治療上遵循“活血化瘀”、“祛瘀生肌”、“偎膿長(zhǎng)肉”等治則,療效確切,使用方便,毒副作用?。?]。七厘散出自《良方集腋》,七厘散又名“傷科七厘散”、“神效七厘散”、“臺(tái)麝七厘散”,是著名的傷科常用中成藥。

    本研究結(jié)果提示,七厘散對(duì)小鼠觸須部皮膚創(chuàng)面有抗炎作用,并促進(jìn)痂皮形成,痂皮的形成時(shí)間較傷科常用龍血竭提早約1d[3],痂皮形成對(duì)創(chuàng)面早期愈合具有積極地意義,阻止外界微生物入侵,防止機(jī)體水分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)丟失,能防止機(jī)械刺激對(duì)創(chuàng)面造成二次損害。七厘散為經(jīng)典傷科復(fù)方,其組成為:血竭、乳香、沒(méi)藥、朱砂、冰片、當(dāng)歸、紅花、麝香、兒茶。方中血竭、紅花、當(dāng)歸活血祛瘀、生肌,乳香、沒(méi)藥行氣散血、消腫止痛,冰片清熱生肌止痛,兒茶清熱定痛生肌、斂創(chuàng)止血,其抗炎生肌的效果優(yōu)于單味藥龍血竭。金因肽的有效成分為EGF,EGF雖亦能促進(jìn)成纖維細(xì)胞及表皮細(xì)胞增殖,但EGF在體內(nèi)的半衰期極短,無(wú)法保持長(zhǎng)期有效濃度。同時(shí),我們還證實(shí)七厘散含藥血清能顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的增殖。成纖維細(xì)胞在皮膚愈合中具有重要作用,其能合成和分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN等細(xì)胞外基質(zhì)成分并參與形組成肉芽組織,肉芽組織不僅能填充皮膚缺損,亦能促進(jìn)表皮細(xì)胞沿著創(chuàng)面周緣向中央遷移;成纖維細(xì)胞分泌的bFGF、VEGF、EGF等細(xì)胞因子又能促進(jìn)創(chuàng)面各種細(xì)胞的增殖,進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[4,5]。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究七厘散促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖的有效成分及其促進(jìn)的分子機(jī)制奠定重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    [1]蔣 森.血瘀論[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2001:33-34,55.

    [2]陳可冀,李連達(dá),翁維良,等.血瘀證與活血化瘀研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2005,3(1):1-2.

    [3]劉愛(ài)軍,易 華,杜標(biāo)炎.龍血竭對(duì)小鼠觸須部毛囊干細(xì)胞增殖和分化的影響[J].陜西中醫(yī),2011,32(8):1089-1092.

    [4]刑 捷,闞華發(fā),唐漢均.中醫(yī)藥促進(jìn)皮膚潰瘍創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究近況[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2008,6(10):1080-1085.

    [5]易成剛,郭樹(shù)中,陳建宗.生肌類中藥的理論與實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床康復(fù),2004,8(29):6470-6471.

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