苦參堿對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響＊

西電集團(tuán)醫(yī)院婦產(chǎn)科 （西安710077）

王 麗 蘇寶山▲ 吳 靜▲

近年來(lái)體內(nèi)外大量研究表明，苦參堿（Matrine，Mat）的抗腫瘤作用全面而廣泛，但對(duì)這些作用機(jī)制的研究較少，至今仍不清楚。目前普遍認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是機(jī)體組織過(guò)度增生與凋亡不足，增生與凋亡失衡的結(jié)果。Bcl-2、COX-2、Fas、Fas L蛋白均是細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮重要作用的分子，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，對(duì)它們的研究，能更深入的了解腫瘤發(fā)生的病因?qū)W，并指導(dǎo)腫瘤的臨床治療。研究表明，宮頸癌組織中COX-2、Bcl-2和Fas L均呈高表達(dá)，F(xiàn)as表達(dá)下降，腫瘤細(xì)胞處于無(wú)限增殖狀態(tài)，發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移［1，2］。本實(shí)驗(yàn)前期已通過(guò)MTT法及流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)證實(shí)Mat有抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡作用，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè) Mat作用宮頸癌 Hela細(xì)胞72h后，Hela細(xì)胞中Bcl-2、COX-2、Fas、Fas L蛋白的表達(dá)水平，初步探討 Mat抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡可能的作用機(jī)制，為Mat應(yīng)用于臨床腫瘤治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材 料

1.1 人宮頸癌Hela細(xì)胞株：由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院癌癥研究所惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑：Mat純度為98%，購(gòu)自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基為美國(guó)GIBCO產(chǎn)品；小牛血清（BCS）杭州四季青生物工程材料研究所；SP試劑盒為武漢博士德生物技術(shù)公司。鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人COX-2單克隆抗體、鼠抗人Fas單克隆抗體、鼠抗人Fas L單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cr uz公司產(chǎn)品，北京中山生物技術(shù)有限公司分裝。

1.3 主要儀器和設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱（SHEL-LAB型，美國(guó)），超凈工作臺(tái)，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Costar公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將宮頸癌Hela細(xì)胞用含10%小牛血清（BCS），青霉素100 U／ml，鏈霉素100μg／ml的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、含5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育傳代培養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法：將無(wú)菌蓋玻片（22 mm×22 mm）鋪在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板里，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞1×106個(gè)／孔接種于已置蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置37℃5%CO2飽度濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h。細(xì)胞貼壁后棄去原液，加Mat溶液終濃度分別為1.0 mg／ml，1.5 mg／ml，2.0 mg／ml，對(duì)照只加 Hela細(xì)胞和培養(yǎng)液，共同培養(yǎng)72h。每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取出有貼壁細(xì)胞的蓋玻片，PBS液漂洗3遍，加入預(yù)先4℃保存的冷丙酮固定5 min，風(fēng)干后貼于載玻片上，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)（SP法），檢測(cè) Mat作用后Bcl-2、COX-2、Fas和Fas L蛋白表達(dá)水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。結(jié)果判定：以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，F(xiàn)as、Fas L染色陽(yáng)性為在細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒 ，胞質(zhì)內(nèi)也有染色，COX-2染色陽(yáng)性為在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，Bcl-2染色陽(yáng)性為在細(xì)胞質(zhì)或核膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒。每片均隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野（400倍），每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，算出陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。綜合考慮爬片中陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比和陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo)，半定量分析判定結(jié)果。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本無(wú)色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分，棕黑色為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞在觀察細(xì)胞中所占比例評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；大于75%為4分。兩類分?jǐn)?shù)乘積0～3分為（-）；4～5分為（+ ）；6～7分為（++）；8分以上為（+++ ）。每組細(xì)胞片檢測(cè)后以+～+++均為陽(yáng)性。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS10.0 for Windows統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。兩組間率的比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，對(duì)照組中Hela細(xì)胞中Fas蛋白表達(dá)較低（+），陽(yáng)性表達(dá)率為16.7%，F(xiàn)as L蛋白呈高表達(dá)（+++），表達(dá)率為81.0%。1.0、1.5、2.0 mg／ml的Mat分別作用于Hela細(xì)胞72h后Fas蛋白表達(dá)明顯逐漸增加，隨著Mat作用劑量增加，Hela細(xì)胞內(nèi)Fas的表達(dá)水平增加，陽(yáng)性率分別為54.2%66.7%和83.3% 與對(duì)照組相比，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義﹙P＜0.05﹚，見(jiàn)表1（圖1、圖2）。1.0、1.5、2.0 mg／ml的Mat分別作用于Hela細(xì)胞72h后Fas L蛋白表達(dá)逐漸減弱，隨著Mat作用劑量增加，Hela細(xì)胞內(nèi)Fas L的表達(dá)水平下降，陽(yáng)性率分別為41.7%、37.5%和29.2%，與對(duì)照組相比，均差異有顯著意義﹙P＜0.05﹚，見(jiàn)表2（圖3、圖4）。

對(duì)照組Hela細(xì)胞胞漿呈棕黃色，Bcl-2蛋白呈高表達(dá)（+++），陽(yáng)性表達(dá)率為91.7%；1.0、1.5、2.0 mg／ml的Mat作用于Hela細(xì)胞72h后Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸下降，隨著Mat作用劑量增加，Hela細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平下降，陽(yáng)性率分別為58.3%、50.0%和33.3%，與對(duì)照組相比，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義﹙P＜0.05﹚，見(jiàn)表3（圖5、圖6）。

COX-2在對(duì)照組正常培養(yǎng)的Hela細(xì)胞胞漿呈深棕色，COX-2蛋白呈高表達(dá)（+++），陽(yáng)性表達(dá)率為95.0%；1.0、1.5、2.0 mg／ml的Mat作用于Hela細(xì)胞72h后COX-2蛋白表達(dá)逐漸下降，隨著Mat作用劑量增加，Hela細(xì)胞內(nèi)COX-2蛋白的表達(dá)水平下降，陽(yáng)性率分別為59.1%、45.5%和27.3%，與對(duì)照組相比，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義﹙P＜0.05﹚，見(jiàn)表4（圖7）。

表1 Mat對(duì)Hela細(xì)胞中Fas蛋白表達(dá)的影響（%）

表2 Mat對(duì)Hela細(xì)胞中Fas L蛋白表達(dá)的影響（%）

表3 Mat對(duì)Hela細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)的影響（%）

圖1 Fas蛋白在對(duì)照組中低表達(dá)（DAB×400）

圖2 Fas蛋白在苦參堿處理組中高表達(dá)（DAB×400）

圖3 Fas L蛋白在對(duì)照組中高表達(dá)（DAB×400）

圖4 Fas L蛋白在苦參堿處理組中低表達(dá)（DAB×400）

圖5 Bcl-2蛋白在對(duì)照組中高表達(dá)（DAB×400）

圖6 Bcl-2蛋白在苦參堿處理組中低表達(dá)（DAB×400）

圖7 COX-2蛋白在苦參堿處理組中低表達(dá)（DAB×400）

表4 Mat對(duì)Hela細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)的影響（%）

討 論

細(xì)胞凋亡是英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)Kerr［3］等人于1972年提出的，凋亡是由多基因控制的細(xì)胞自主性程序化死亡過(guò)程，是機(jī)體對(duì)異常細(xì)胞、衰老細(xì)胞或潛在異常增生細(xì)胞的一種清除手段。研究表明，細(xì)胞凋亡通路較多，主要有三條通路［4］，就是死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，三條通路密切關(guān)聯(lián)，均激活不同的Caspase執(zhí)行細(xì)胞凋亡作用。Caspase可降解細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白、DNA修復(fù)酶等多種蛋白執(zhí)行凋亡過(guò)程。通過(guò)調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)治療腫瘤已經(jīng)成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。Fas／Fas L介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡就是通過(guò)經(jīng)典的死亡受體通路。研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞表達(dá)Fas L與腫瘤的免疫逃逸有關(guān)。已知T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞表面均有Fas表達(dá)，特別是活化的T淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)水平更高，當(dāng)表達(dá)Fas的免疫細(xì)胞與表達(dá)Fas L的腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，激活Fas／Fas L信號(hào)傳遞途徑，引起免疫細(xì)胞的凋亡，使得腫瘤細(xì)胞逃避免疫殺傷。近年研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞表面，如宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等細(xì)胞表面均有Fas L表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)Fas的淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，腫瘤細(xì)胞對(duì)宿主免疫系統(tǒng)有主動(dòng)攻擊作用；而腫瘤細(xì)胞Fas表達(dá)越高，與自身的Fas L結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，引起細(xì)胞凋亡［5］。

Bcl-2即B細(xì)胞淋巴瘤／白血病-2，屬于Bcl-2家族成員，定位于18q21.3號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)230kb。Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中起重要調(diào)控作用。Bcl-2可與Bcl-2家族的Bcl-X1、Bcl-Xs、Bax、Bcl-2、Bad和Mc1-1形成同源或異源的蛋白二聚體形式，二聚體間以網(wǎng)絡(luò)的形式相互作用，而特定的蛋白二聚體則可作為在細(xì)胞死亡信號(hào)通路上的分子開(kāi)關(guān)，調(diào)控細(xì)胞的凋亡［6］。研究發(fā)現(xiàn)，早期宮頸癌中，致癌因子引起B(yǎng)cl-2的過(guò)度表達(dá)，抑制了細(xì)胞凋亡，促使腫瘤的生長(zhǎng)；在晚期宮頸癌中，由于多個(gè)癌基因和抑癌基因的影響，Bcl-2的表達(dá)下降，因此細(xì)胞內(nèi)Bcl-2基因的過(guò)度表達(dá)可能是宮頸癌的早期事件。

COX是花生四烯酸合成前列腺素（PGs）的關(guān)鍵酶，有兩種異構(gòu)體，其中COX-2是一個(gè)重要原癌基因，在正常組織中不表達(dá)，可被多種因素如細(xì)胞因子、內(nèi)毒素、致癌因子誘導(dǎo)，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡變及轉(zhuǎn)移、尤其促進(jìn)新生血管形成，影響癌的發(fā)生和發(fā)展［7］。研究發(fā)現(xiàn)敲除COX-2基因可顯著減少腸道腫瘤和皮膚乳頭狀瘤的發(fā)生［8］。研究顯示，在宮頸癌中COX-2表達(dá)顯著增高［9］。近年來(lái)，針對(duì)COX-2為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療研究也越來(lái)越多。選擇性COX-2抑制劑在腫瘤防治中有廣闊前景。

Mat是從豆科槐屬植物苦豆子中提取的單一生物堿，化學(xué)分子成為作為抗癌中藥，大量研究已經(jīng)證實(shí)，Mat有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［11］。檢測(cè)凋亡可通過(guò)多種方法，除了細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀、原位末端標(biāo)記法測(cè)凋亡率外，還可用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)用免疫細(xì)胞化學(xué)（SP）法檢測(cè)了Mat作用宮頸癌Hela細(xì)胞72h后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制凋亡蛋白Bcl-2、COX-2及Fas L表達(dá)下降，促凋亡蛋白Fas表達(dá)增加，說(shuō)明Mat下調(diào)Bcl-2、COX-2及Fas L表達(dá)，增加Fas的表達(dá)，可能是其誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，為靶向治療宮頸癌提供了新的思路，至于具體詳細(xì)的機(jī)制還有待研究。

［1］張 璇，陳 莉，曉 宵，等.COX-2和NET-1基因蛋白在宮頸癌中表達(dá)的意義［J］.腫瘤防治研究，2006，33（4）：252-255.

［2］朱 青，韓蘇夏，李明眾，等.放療前后宮頸癌細(xì)胞凋亡及Fas、P53及bcl-2的表達(dá)［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2006，14（6）：730-732.

［3］Kerr JFR，Wyllie AH，Cunie AR.Apoptosis basic biological pheno menon with wide ranging i mplications in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，26：239-257.

［4］Nakagawa T，Zhu H，Morishi ma N，etal.Caspase-12 mediates endoplas mic-reticulu m-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta［J］.Nature，2000，403（6765）：98-103.

［5］Kase H，Aoki Y，Tanaka K.Fas ligand expression in cervical adenocarcino ma：relevance to ly mph node metastasis and tu mor progression［J］.Gynecol Oncol，2003，90（1）：70-74.

［6］Tho madaki H，corilas A.Bcl-2 fa mily of apoptosis-related genes：f unction And clinical i mplications in cancer［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2006，43（1）：1-67.

［7］吳 永，王和勇，張培德，等.環(huán)氧合酶-2在腫瘤浸潤(rùn)合轉(zhuǎn)移中德作用和治療研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8（8）：1580-1583.

［8］Rigas B，Kashfi K.Cancer prevention：A new era beyond COX-2［J］.J Phar macol Exp Ther，2005，314：1-8.

［9］Ferrandina G，Ranelletti F O，Legge F，etal.Prognostic role of the radio bet ween cyclooxygenase-2 in tu mor and stro ma co mpart ments in cervical cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10（9）：3117.

［10］蘇麗梅，戴貴東，聶黎紅，等.苦參堿對(duì)豚鼠離體膽囊平滑肌條收縮功能的影響［J］.陜西中醫(yī)，2010，31（7）：916-918.

［11］司維柯，尚桃元，康格非.苦參堿對(duì)人肝癌細(xì)胞 Hep G2的細(xì)胞形態(tài)影響和相關(guān)增殖因素的變化［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22（6）：553-556.