超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定乳及乳制品中三聚氰胺

胡強(qiáng)，王延云，李超豪，吳衛(wèi)，向樂(lè)曦，楊春林

1(樂(lè)山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川樂(lè)山，614000)2(樂(lè)山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂(lè)山，614000)

三聚氰胺屬于三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，是一種化工原料，廣泛運(yùn)用于塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電器、醫(yī)藥等行業(yè)。三聚氰胺含氮量高(66.6%)，因此，某些不法廠商為了降低生產(chǎn)成本，利用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采用凱氏定氮法只能檢測(cè)含氮量并不能鑒定其化學(xué)成分的缺陷［1］，在飼料中添加三聚氰胺或直接在乳及乳制品中添加三聚氰胺，提高食品檢測(cè)中蛋白質(zhì)含量指標(biāo)［2－4］。三聚氰胺被認(rèn)為有輕微毒性，長(zhǎng)期或反復(fù)大量攝入三聚氰胺將會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌［5］。因此，乳及乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法的研究有著非常重要的意義。

目前，關(guān)于乳及乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)［6］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)［7］、高效液相色譜法(HPLC)［8－9］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)［10－14］。由于乳及乳制品樣品基質(zhì)復(fù)雜，ELISA易出現(xiàn)假陽(yáng)性，且陽(yáng)性樣品需進(jìn)一步確證分析;GC-MS法前處理采用衍生化，操作過(guò)程繁瑣;HPLC和LC-MS/MS法前處理采用固相萃取凈化，試劑及耗材成本較高［15－17］。本研究選擇提取液經(jīng)超聲波提取、液液萃取和稀釋，除去蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)，利用UPLC-MS/MS法，建立快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、靈敏的乳及乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉、液態(tài)乳、酸奶樣品市購(gòu)。

三聚氰胺(純度99.5%)，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、乙酸為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Tedia公司;0.22 μm微孔濾膜，購(gòu)自美國(guó)Waters公司;二氯甲烷、乙酸銨、鹽酸，均為優(yōu)級(jí)純。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC I-Class+Xevo TQD超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)，配有FTN自動(dòng)進(jìn)樣器、BSM二元泵、CH-A柱溫箱、ESI電離源和MassLynxTM4.1工作站;Milli-Q Academic超純水裝置(美國(guó)Millipore公司);SG5200HPT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);TG-20臺(tái)式高速離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司)。

1.3 色譜分析條件

色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1 mm ×75 mm，1.7 μm);流動(dòng)相為 80% 乙腈和20%水;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:2μL;流速0.6 mL/min。

質(zhì)譜條件ESI正離子檢測(cè)模式，毛細(xì)管電壓3.5 kV，萃取電壓3 V，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度為550℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，脫溶劑氣流速600 L/h，錐孔氣流速50 L/h，碰撞氣為高純氬氣，碰撞室的壓力35MPa。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，離子對(duì)駐留時(shí)間(dwell time)均為0.163 s，選擇離子監(jiān)測(cè)條件，見(jiàn)表2。

表1 MRM監(jiān)測(cè)模式下的監(jiān)測(cè)條件

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取0.100 0 g(精確到0.1 mg)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇-水溶液(體積比1∶1)溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于0～4℃下避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:用基質(zhì)空白溶液將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，得到質(zhì)量濃度為0.5～100 μg/L系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取約0.5 g(精確至0.001 g)樣品于15 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL乙腈-水溶液(體積比1∶1)，渦旋30 s，然后超聲提取 25 min，以8 000 r/min離心10 min，提取液轉(zhuǎn)入25 mL比色管中，加入150 μL HCl(1 mol/L)和10 mL二氯甲烷，閉塞震蕩20 min，然后以8 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL加入4 mL乙腈稀釋，混勻后過(guò)0.22 μm濾膜，濾液供UPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的選擇

乳及乳制品中主要含有蛋白質(zhì)、脂肪等成分，本研究通過(guò)對(duì)選取提取液、超聲波提取、液液萃取和適當(dāng)稀釋等前處理步驟的優(yōu)化，盡可能降低基質(zhì)效應(yīng)、提高檢測(cè)重復(fù)性和靈敏度。三聚氰胺可溶于乙腈，乙腈，而它們具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，因而提取液選擇乙腈-水溶液，選取 V(乙腈)∶V(水)=8∶2、7∶3、6∶4、5∶5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在 V(乙腈)∶V(水)=5∶5時(shí)，三聚氰胺提取效率較高，且蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀效果較好;超聲波提取是為了增強(qiáng)提取液對(duì)樣品中三聚氰胺的提取效率，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲波提取時(shí)間為25 min時(shí)，三聚氰胺提取效率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲波提取時(shí)間并不能提高三聚氰胺提取效率;乳與乳制品樣品中至少含有3%的脂肪，使用二氯甲烷通過(guò)液液萃取除去樣品中的脂肪;提取液用乙腈以1∶4倍稀釋，降低濃度減少潛在干擾。

2.2 色譜條件的選擇

色譜柱選擇，三聚氰胺具有強(qiáng)極性和親水性特點(diǎn)，在普通反相色譜柱上幾乎無(wú)保留［18］。因此，本研究選用了ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱，該色譜柱采用1.7μm未經(jīng)鍵合的亞乙基橋雜化顆粒，適用于保留強(qiáng)極性、水溶性分析物，并且適合高有機(jī)相比例分析條件，同時(shí)能有效的提高分離能力、分析速度和靈敏度［19］。從圖1可以看出，采用乙腈-水體系作為流動(dòng)相，在電噴霧離子源(ESI)正離子掃描模式和最佳質(zhì)譜條件下，三聚氰胺的保留時(shí)間為0.51 min，定量、定性離子對(duì)分別為126.9/85.0、126.9/68.0。

圖1 三聚氰胺在乙腈-水體系下分離的TIC色譜圖(濃度為 2 μg/L)

流動(dòng)相的選擇，對(duì)于UPLC-MS/MS來(lái)說(shuō)，不僅要考慮對(duì)組分的洗脫能力，而且還需考慮在質(zhì)譜中是否能促使目標(biāo)化合物達(dá)到較高的離子化效率。本研究分別對(duì)乙腈-水體系、GB 22388－2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》中采用的乙腈-10 m mol/L乙酸銨(用乙酸調(diào)節(jié)至 pH值3.0)體系［20］、及 Desmarchelier等［21］報(bào)道的乙腈-10 m mol/L乙酸銨體系進(jìn)行比較。從圖2可以看出，濃度為10 μg/L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在乙腈-水體系和乙腈-10 m mol/L乙酸銨體系下離子豐度和信噪比均無(wú)明顯差異，而在乙腈-10 m mol/L乙酸銨(用乙酸調(diào)節(jié)至pH值3.0)體系下離子豐度和信噪比均低40倍左右。因此選擇乙腈-水體系作為本方法的流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

配制一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動(dòng)注射泵連續(xù)直接進(jìn)入質(zhì)譜，利用IntelliStartTM技術(shù)，質(zhì)譜自動(dòng)對(duì)三聚氰胺進(jìn)行特異性MRM數(shù)據(jù)采集方法的開發(fā)，確定了在ESI正離子模式下，三聚氰胺的準(zhǔn)分子離子［M+H］+為126.9，定量、定性離子對(duì)分別為126.9/85.0、126.9/68.0，及其相應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量。最后手動(dòng)優(yōu)化了毛細(xì)管電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、脫溶劑氣流速、錐孔氣流速等參數(shù)，確定最佳質(zhì)譜條件。

圖2 三聚氰胺在不同流動(dòng)相分離的TIC色譜圖(濃度為 10 μg/L)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢測(cè)限

將上述配制成的質(zhì)量濃度為0.5～100 μg/L系列的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，在UPLC-MS/MS上進(jìn)行測(cè)定，以定量離子峰面積為Y，各標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為X，得到線性回歸方程為Y=372.036X－57.505 1，相關(guān)系數(shù)為0.999 1;在空白樣品中逐級(jí)添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)濃度為5 μg/kg時(shí)，得到方法檢出限(LOD，S/N=3)為 0.005 mg/kg，方法定量限(LOQ，S/N=10)為0.017 mg/kg。

2.5 方法的精密度和回收率

將3個(gè)添加不同濃度水平的液態(tài)乳、乳粉、酸奶樣品按2.1方法進(jìn)行樣品前處理和LC-MS/MS分析。在同一條件下每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，添加回收率為91.3% ～97.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于9.03%，說(shuō)明本方法是準(zhǔn)確可靠的。

表2 三聚氰胺加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

建立了快速、經(jīng)濟(jì)檢測(cè)乳及乳制品中三聚氰胺含量的UPLC-MS/MS分析方法。乳及乳制品樣品采用乙腈-水(體積比5∶5)為提取液，經(jīng)超聲波提取、液液萃取除去蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)后，適當(dāng)稀釋直接進(jìn)樣，在1.2 min內(nèi)完成樣品分析。前處理省去了衍生化或固相萃取凈化的繁瑣操作過(guò)程，降低了試劑及耗材成本，分析階段采用UPLC-MS/MS節(jié)約了分析時(shí)間和增強(qiáng)了定性的準(zhǔn)確性。該方法檢出限和定量限分別為0.005、0.017 mg/kg;不同濃度水平加標(biāo)平均回收率為91.3% ～97.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于9.03%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測(cè)方法快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、靈敏，適合我國(guó)乳及乳制品中三聚氰胺的定性、定量檢測(cè)要求。

［1］GB 5009.5－2010.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定［S］.

［2］黃芳，黃曉蘭，吳惠勤，等.高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)飼料及食品添加劑中三聚氰胺的測(cè)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27(3):313－315.

［3］黃敏.食品和飼料中三聚氰胺檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.食品科技，2011，36(11):301－305.

［4］周楊，馮群科，朱永林.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中三聚氰胺［J］.中國(guó)飼料，2010，12:33－36.

［5］Yang H H，Zhou W H，Guo X C，et al.Molecularly imprinted polymer as SPE sorbent for selective extraction of melamine in dairy products［J］.Talanta，2009，80:821－825.

［6］趙寧，徐飛，吳小平，等.ELISA一步法快速檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38(4):124－126.

［7］劉世鵬，雷迎，黃國(guó)旺，等.三聚氰胺檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2012，33(3):50－53.

［8］Sun H W，Wang L X，Ai L F，et al.A sensitive and validated method for determination of melamine residue in liquid milk by reversed phase high-performance liquid chromatography with solid-phase extraction［J］.Food Control，2010，21:686－691.

［9］梁劍，鐘茂生，朱品玲，等.水產(chǎn)品中三聚氰胺含量的快速檢測(cè)方法研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(28):13 446－13 447.

［10］Goscinny S.，Hanot V.，Halbardier J-F.，et al.Rapid analysis of melamine residue in milk，milk products，bakery goods and flour by ultra-performance liquid chroma-tography tandem mass spectrom etry From food crisis to accreditation［J］.Food Control，2011，22:226－230.

［11］趙善貞，鄧曉軍，伊雄海，等.固相萃取-親水相互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中三聚氰胺和三聚氰酸［J］.色譜，2012，33(7):677－683.

［12］盧躍鵬，方慧文，胡筱靜，等.親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定液態(tài)奶中三聚氰酸和三聚氰胺［J］.分析試驗(yàn)室，2010，29(11):94－97.

［13］王飛，曹彥忠，李學(xué)民，等.固相萃取-超高壓液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中的三聚氰胺［J］.中國(guó)蜂業(yè)，2011，62:42－45.

［14］王靜，劉錚錚.使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析水樣中三聚氰胺［J］.環(huán)境化學(xué)，2011，30(10):1 828－1 829.

［15］Lutter P，Savoy-Perroud M C.，Campos-Gimenez E.，et al.Screening and confirmatory methods for the determination of melamine in cow’s milk and milk-based powdered infant formula Validation and proficiency-tests of ELISA，HPLC-UV，GC-MS and LC-MSMS［J］.Food Control，2011，22:903－913.

［16］徐競(jìng).面粉中三聚氰胺的高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定［J］.現(xiàn)代面粉工業(yè)，2009，3:37－39.

［17］趙慧芬，水明，張雪林，等.液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定乳品中三聚氰胺含量的簡(jiǎn)便方法［J］.乳品加工，2009(1):43－45.

［18］胡梅，王駿，張卉，等.超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定禽蛋制品中三聚氰胺［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，(1):90－93.

［19］Michael J Yelle.Waters液相色譜柱及消耗品簡(jiǎn)要指南2012/2013［M］.北京:沃特世公司中國(guó)印刷，2012:58－59.

［20］GB/T 22388－2008.原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法［S］.

［21］Desmarchelier A，Guillamon-Cuadra M，Delatour T，et al.Simultaneous quantitative determination of melamine and cyanuric acid in cow’s milk and milk-based infant formula by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(16):7 186－7 193.