傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中丙烯酰胺檢測的HPLC-MS方法構建

張帥，梁桂娟，吳世蘭，秦禮康

1(貴州大學，貴州貴陽，550025)2(貴州省產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院，貴州 貴陽，550003)

丙烯酰胺(acrylamide，AA)是一種不飽和酰胺［1］，食品中的丙烯酰胺之所以受到關注是因為它的毒性(俗稱丙毒)。2002年4月，由瑞典國家食品管理局和斯德哥爾摩大學聯(lián)合宣稱，在食品中含有對人體具有潛在致癌性的丙烯酰胺，尤其是以薯條為代表的富含碳水化合物的高溫油炸食品中含量最為豐富［2］。該問題引起了國際社會的高度重視，WHO/FAO把食品中的丙烯酰胺作為優(yōu)先評估對象［3］。此外，丙烯酰胺已被證明具有神經(jīng)毒性、基因毒性和生殖毒性［4－7］。

目前，對食品中丙烯酰胺的研究主要集中于高淀粉含量油炸食品、焙烤食品以及飲用水。有研究認為，高淀粉含量油炸食品、焙烤食品為高溫、低濕的典型的Maillard反應體系，其反應產(chǎn)物一部分對食品色澤、風味的形成具有重要作用，但同時也產(chǎn)生了醛類、雜環(huán)胺等有害的中間產(chǎn)物，隨后通過一系列復雜化學變化產(chǎn)生丙烯酰胺［1，8］。國內外測定食品中AA的方法一般采用 GC-MS、HPLC、HPLC-MS或 HPLC-MS/MS［9－12］。美國 FDA 發(fā)布了采用 HPLC-MS/MS，以13C3-丙烯酰胺為內標的同位素稀釋技術測定食品中丙烯酰胺的含量［13－14］。

豆豉、腐乳、豆醬以及醬油等豆類傳統(tǒng)發(fā)酵調味品，現(xiàn)已發(fā)展成為我國最具優(yōu)勢和特色的新興產(chǎn)業(yè)。但是，產(chǎn)品發(fā)酵過程中易受原料品質波動、雜菌污染以及環(huán)境因素的影響，產(chǎn)品質量極難穩(wěn)定，存在較大的安全隱患，如生物胺、病原微生物及其毒素等內源性污染物，這些都已成為高蛋白豆類發(fā)酵調味品工業(yè)的安全隱患因子。為有效評價發(fā)酵豆制品中AA的含量狀況，研究發(fā)酵豆制品中產(chǎn)生AA的機理以及相應的控制措施，目前迫切需要建立穩(wěn)定、準確、快速簡便的測定發(fā)酵豆制品中AA的方法。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

丙烯酰胺標準品:純度＞99.8%，美國Sigma公司;13C3-丙烯酰胺標準品，英國Cambridge Isotope Laboratories。甲醇、甲酸:色譜純;超純水;乙酸鋅［Zn(CH3COO)2］，亞鐵氰化鉀［K4Fe(CN)6］:分析純;PES 0.22 μm水相濾膜。腐乳、豆豉以及豆醬均購自于貴陽市花溪合力超市與佳宇超市。

1.2 儀器和設備

UPLC-TQD Waters高效液相四級桿串聯(lián)質譜儀(美國Waters公司);6 mL 200 mg OASIS固相萃取柱(美國 Waters公司);X-22R冷凍離心機(美國BECKMAN公司);Multi Reax旋渦混合器(德國Heidolph公司);Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)(中國密理博公司)。

2 實驗方法

2.1 標準溶液的配制

準確稱取10 mg丙烯酰胺標準品，精確至0.01 mg，置于100 mL容量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，1～4℃低溫保存作為儲備溶液。分別配制0.01，0.05，0.1，0.2，1 μg/mL 的 AA 標準溶液，13C3-丙烯酰胺為內標，濃度為1 μg/mL。

2.2 樣品處理

稱取樣品1.0 g于50 mL離心管內，加500 μL 1 μg/mL的內標液(13C3-AA)，加入20 mL石油醚，振蕩15 min，棄去石油醚，反復操作2次。加乙酸鋅與亞鐵氰化鉀各3 mL進行蛋白質的沉淀，加入超純水定容至20 mL，振蕩15 min，冷凍離心(4℃，3 600 r/min)15 min，過濾待用。HLB固相萃取柱(6 mL 200 mg OASIS)先用5 mL甲醇活化和5 mL超純水平衡，然后吸取待用液2 mL緩慢通過HLB固相萃取柱，1 mL超純水淋洗，最后用2 mL 40%甲醇水溶液(含有0.01%甲酸)洗脫，收集洗脫液。過0.22 μm水相濾膜，備用待測。

2.3 色譜條件

ACQUITY UPLC C18色譜柱(210 mm×20 mm，1.7 μm，美國 Waters公司);柱溫:30℃;流速:0.2 mL/min;進樣量:5 μL;流動相:超純水-甲醇(99∶1，其中分別加入0.1%甲酸)。

2.4 質譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測方式:MRM;離子源溫度:120℃;脫溶劑氣溫度:350℃;定性、定量離子對，碰撞能量以及錐孔電壓見表1。

表1 丙烯酰胺的質譜參數(shù)

2.5 結果計算

試樣中AA含量的計算:

其中，X為樣品中丙烯酰胺的含量，mg/kg;A為質譜儀測定的丙烯酰胺的含量，ng/mL;2為待用液過HLB固相萃取柱體積，mL;N為稀釋倍數(shù);R/%為回收率;m為樣品質量，g。

計算結果保留3位有效數(shù)字。

3 結果與討論

3.1 丙烯酰胺標準曲線回歸方程

將 0.01，0.05，0.1，0.2，1 μg/mL 標準溶液依次進樣，計算標準曲線的回歸方程和相關系數(shù)。曲線回歸方程(Y為響應值，X為試樣質量濃度)Y=81.827 6X+415.248，相關系數(shù) R=0.992 425，R2=0.984 907，該方法在0.01～1 μg/mL都有良好的線性。見圖1。

圖1 丙烯酰胺標準曲線圖

3.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

本實驗以13C3-丙烯酰胺為內標，濃度為1 μg/mL，使用固相萃取柱進行萃取，其中洗脫液(甲醇水溶液)的濃度對回收率影響較大。實驗選取3組樣品，分別在洗脫液濃度為20%，40%，60%，80%下對回收率進行分析，結果見表2。

表2 不同濃度洗脫液對回收率的影響 %

3.3 液相色譜條件的優(yōu)化

選擇超純水與甲醇(0.1%甲酸)作為流動相，發(fā)現(xiàn)流動相配比在超純水與甲醇的體積比為99∶1的條件下峰形較其他參考條件下［15－17］峰形好，可以顯著改善拖尾現(xiàn)象。由于丙烯酰胺在質譜儀中分解為正離子，因此，加入0.1%的甲酸，能顯著提高響應強度。圖2為不同流動相條件下的質譜圖。圖a流動相為超純水-甲醇(95∶5，分別添加0.1%甲酸);圖b流動相為超純水-甲醇(99∶1，分別添加0.1%甲酸)。從圖2可以看出，加大流動相中超純水的比例，可以顯著延長丙烯酰胺的出峰時間，從而有效分離目標峰與雜質峰。

3.4 質譜條件的優(yōu)化

由于丙烯酰胺的相對分子質量較低，因此所得碎片離子質量也低。選擇MRM方式進行定量檢測時靈敏度高，重現(xiàn)性好。通過預實驗發(fā)現(xiàn)，母離子(m/z 72)通過脫氨能夠得到子離子(m/z 55)，具有較高的相對豐度，當施加的碰撞能為12 eV時，達到最大值，當使用定性子離子(m/z 44)需要更大的碰撞能量，因此，選擇m/z 55作為定量離子。丙烯酰胺的色譜圖見圖3。圖a表示13C3-丙烯酰胺的質譜圖，m/z為74.79∶58;圖b表示丙烯酰胺定量時質譜圖，m/z為72.2∶55;圖c表示丙烯酰胺定性是質譜圖，m/z為72.2∶44;圖d表示總離子流圖。

圖2 不同流動相條件下質譜圖的比較

3.5 方法精密度與加標回收率

以腐乳、豆豉、豆醬3種不同類型樣品，加入1 mL 內標液(13C3-AA)，濃度分別為 1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.1 μg/mL。測得該方法的回收率范圍，相對標準偏差(RSD)。測定結果見表3、表4和表5。從表中可以看出，腐乳的回收率在84.0%～88.3%，平均回收率為86.6%。豆豉的回收率在90.1%～93.1%之間，平均回收率為91.7%。豆醬的回收率在83.9%～87.4%，平均回收率為85.0%。它們的相對標準偏差(RSD)(n=5)均小于10%。因此，該方法可以用來分析測定腐乳、豆豉以及豆醬中丙烯酰胺的含量。

3.6 各樣品中丙烯酰胺的含量

使用該實驗方法，對不同地區(qū)不同品牌的豆豉、豆醬以及腐乳中的丙烯酰胺的含量進行了分析檢測，結果見表6。

圖3 13C3-丙烯酰胺內標物與丙烯酰胺標品測定的HPLC-MS圖

表3 腐乳的回收率實驗

表4 豆豉的回收率實驗

表5 豆醬的回收率實驗

表6 樣品中丙烯酰胺的含量

從表6中的數(shù)據(jù)可知，在選取的豆豉樣品中，丙烯酰胺的含量范圍在1～15 mg/kg之間，豆醬在0.4～2 mg/kg之間，腐乳在2～8 mg/kg之間。豆豉中丙烯酰胺的含量明顯高于腐乳與豆醬，而采用不同菌種進行發(fā)酵的豆豉中丙烯酰胺的含量也差異明顯。

在表6中，編號1～6的樣品發(fā)酵采用的菌種為曲霉，7～9為毛霉，10～14為細菌?？梢钥闯?，曲霉發(fā)酵的豆豉丙烯酰胺含量普遍偏高，毛霉型次之，細菌型普遍較低。

發(fā)酵豆制品中產(chǎn)生丙烯酰胺的途徑可能有2種:

一是在生產(chǎn)加工過程原材料中還原糖和氨基發(fā)生的Maillard反應。在豆豉生產(chǎn)過程中，其中一步驟為蒸煮與冷卻。此時的外界環(huán)境從高溫轉為低溫，濕度很高，而伴隨著原材料中本身含有的還原糖和氨基化合物，極有可能發(fā)生非典型Maillard反應，為丙烯酰胺的產(chǎn)生提供了物質基礎，再通過隨后的一系列化學反應產(chǎn)生丙烯酰胺。

二是由于其中微生物的生理生化過程中，在酶的作用下，產(chǎn)生了一系列丙烯酰胺的前體物質，如丙二醛、丁二酮、丙酮醛等，再反應形成丙烯酰胺。接種時曲霉型、毛霉型以及細菌型發(fā)酵豆豉的區(qū)別在于所接種的微生物類型不同。曲霉發(fā)酵的豆豉中曲霉類型主要有巢狀亞屬巢狀組埃及曲霉(Aspergillus egyptiacus Moub.＆Moust.)，煙色亞屬煙色組煙曲霉原變種(Aspergillus fumigatus)和環(huán)繞亞屬黃綠組寄生青霉群(Aspergillus oryzae)［18］。毛霉發(fā)酵的豆豉所接種的主要以總狀毛霉為主，但也有一定數(shù)量的枯草芽孢桿菌存在［19－20］。而細菌型豆豉則主要采用的是自然接種，參與的微生物主要有豆豉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌及微球菌［21］。在產(chǎn)生丙烯酰胺的第2種途徑來看，可能由于各種微生物酶系的差異，導致發(fā)酵過程中外界環(huán)境所影響的自身酶系活力的差異，最終影響了丙烯酰胺的含量。

4 結論

本實驗建立了使用HPLC-MS測定中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中丙烯酰胺含量的方法。由于出峰時間短，樣品前處理簡便，使用電噴霧四級桿質譜儀MRM掃描方式靈敏度高，重現(xiàn)性好，能更好滿足發(fā)酵豆制品中丙烯酰胺含量的測定。從丙烯酰胺測定的結果來看，由于飲用水是人體攝入丙烯酰胺的主要來源，許多國家規(guī)定飲用水中含量不能超過0.25 mg/kg，瑞典研究人員推定消費者食品中丙烯酰胺的平均暴露量為40μg/(人·d)［22］。從表6的測定結果來看，中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中丙烯酰胺含量偏高，因此，其中丙烯酰胺產(chǎn)生的具體機理以及如何控制降低其含量還有待進一步的研究分析。

［1］劉潔，袁媛，胡小松，等.食品中丙烯酰胺形成途徑的研究進展［J］.中國糧油學報，2009(24):160－163.

［2］Swedish NFA.Information About Acrylamide in Food［N］.Swedish National Food Administration，2002－4－24.

［3］FAO/WHO.64th Joint fao/who expert committee on food additives Rome［Z］.2005－02－8－17.

［4］劉仁平，童建.丙烯酰胺毒性的最新研究進展［J］.職業(yè)與健康，2006，22(1):12 －14.

［5］于素芳，謝克勤.丙烯酰胺的神經(jīng)毒性研究概況［J］.毒理學雜志，2005，19(3):242 －244.

［6］馬紅蓮，楊建一.丙烯酰胺遺傳毒性研究進展［J］.山西醫(yī)科大學學報，2007，38(8):754 －756.

［7］王皓，李建，石放雄.丙烯酰胺的生殖毒性及其影響機理［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009，41(3):96 －98.

［8］劉稷燕，江桂斌.食品中丙烯酰胺及其形成機制［J］.化學進展，2004，16(6):1 000 －1 007.

［9］Mottram DS，Bronislaw L W，Dodson AT.Arcylamide is formed in the Maillard reaction［J］.Nature，2002，419:448－449.

［10］茅力，陸曉梅，楊葉，等.高效液相色譜法檢測淀粉類食品中丙烯酰胺的方法［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，4(4):724－726.

［11］章宇，焦晶晶，張英，等.液相色譜-串聯(lián)質譜法測定焙烤和油炸食品中丙烯酰胺的含量［J］.中國食品學報，2007，7(1):131 －137.

［12］簡黎黎，劉潔，袁媛，等.HPLC-MS/MS法定量方便面中的丙烯酰胺［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(12):391－394.

［13］Denis Andrejewski，John A G Roach，Martha L Gay，et al.Analysis of coffee for the presence of acrylamide by LCMS/MS［J］.J Agric Food Chem，2004，52:1 996 －2 002.

［14］Denis Andrejewski，John A G Roach，Martha L Gay，et al.Rugged LC-MS/MS survey analysis for acrylamide in foods［J］.J Agric Food Chem，2003，51:7 547 －7 554.

［15］何愛桃，楊勝園，薛金花，等.固相萃取高效液相色譜法測定油炸食品中丙烯酰胺［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18(12):2 453 －2 455.

［16］樊祥，方曉明，陳家華，等.液相色譜-串聯(lián)四級桿質譜對食品中丙烯酰胺的測定研究［J］.分析測試學報，2005，24(3):82 －85.

［17］張凌云，劉波，徐榮，等.液相色譜-串聯(lián)質譜法測定飲用水中的丙烯酰胺［J］.環(huán)境化學，2010，29(1):152－153.

［18］張建華，李輝，李里特.曲霉型豆豉曲中微生物分布［J］.中國調味品，2006(9):15 －20.

［19］李幼筠，甘萍，黃水泉.毛霉型豆豉生產(chǎn)菌種的研究［J］.中國釀造，1989(8):29 －31.

［20］苗蘭蘭，曹龍奎，吳澤柱，等.永川豆豉中高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選鑒定及液體培養(yǎng)的研究［J］.農產(chǎn)品加工學刊，2009(5):66－69.

［21］李祥.細菌性豆豉生產(chǎn)的研究［J］.中國調味品，1999(10):14－17.

［22］陳芳，袁媛，劉野，等.食品中丙烯酰胺研究進展［J］.中國糧油學報，2006，21(2):124 －128.