SPME-GC-MS分析不同商業(yè)葡萄酒酵母香氣物質(zhì)合成的差異性*

秦偉帥，趙新節(jié)，張娜，翟衡

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東省作物生物學(xué)重點實驗室，山東泰安，271018)2(山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東省微生物工程重點實驗室，山東濟南，250353)

揮發(fā)性香氣化合物是葡萄酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，主要包括醇類、酯類、萜烯類、醛酮類和酚類等［1－2］。這些成分的種類、含量、感官閾值及其之間的相互作用影響著葡萄酒的風(fēng)味和典型性。

近年來，國內(nèi)外在酵母對葡萄酒香氣物質(zhì)的影響研究方面做了大量工作。通過研究發(fā)現(xiàn)，不同酵母發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒，酒中香氣成分差別微小，而含量差別明顯。Giacomo Mauriello等人對意大利葡萄酒產(chǎn)區(qū)的36種酵母發(fā)酵的葡萄酒進行氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)，不同菌株發(fā)酵的葡萄酒香氣成分含量差距較大［3］。潘秋紅等人研究了3種酵母對貴人香干白葡萄酒香氣的影響，結(jié)果表明，不同酵母菌株的產(chǎn)酸、產(chǎn)醇和產(chǎn)酯能力存在很大差異［4］。目前，研究酵母香氣物質(zhì)代謝通常有葡萄品種香氣的參與，而在模擬葡萄汁培養(yǎng)基中關(guān)于酵母自身香氣物質(zhì)合成的研究較少。在應(yīng)用GC－MS技術(shù)對葡萄酒香氣進行分析時，Pawliszyn等人于1990年研發(fā)出了固相微萃取技術(shù)(簡稱SPME)［5］。該技術(shù)高效、簡單、快速且成本低。目前，已經(jīng)在果實及酒類分析檢測中得到廣泛應(yīng)用［6－7］。

本研究以4株商業(yè)葡萄酒酵母為試驗材料，采用HS－SPME－GC－MS方法分析酵母代謝的香氣物質(zhì)，通過模擬葡萄汁發(fā)酵法研究確定釀酒酵母自身香氣物質(zhì)合成的差異性，為葡萄酒釀造中酵母菌株的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

商業(yè)釀酒酵母菌株:CY3079、D254、EC1118和RC212，均于2011年購自上海杰兔工貿(mào)有限公司。

1.2 試劑

香氣標準品:乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、2-苯乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸、己酸、辛酸和癸酸，均購自美國Sigma公司;內(nèi)標物4-甲基-2-戊醇(色譜醇98%)購自美國Aldrich公司;NaCl(分析純)。

1.3 儀器與設(shè)備

手動 SPME進樣器、萃取頭 50/30 μm DVB/CAR/PDMS，美國 Supelco公司;GC-2010/QP 2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本Shimadzu公司;Stabilwax-DA毛細管柱(30 m ×0.32 mm×0.25 μm)，美國J＆W公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母生長條件

將酵母分別接種到3 mL YPD培養(yǎng)基上(1%酵母浸粉、2%蛋白胨和2%葡萄糖)，28℃培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)接到50 mL改良的MS300培養(yǎng)基(葡萄糖和果糖濃度分別為60 g/L)，上25℃搖瓶好氧培養(yǎng)24 h。然后接種到100 mL三角瓶中厭氧發(fā)酵(含有80 mL MS300培養(yǎng)基)。MS300培養(yǎng)基成分包括:120 g/L葡萄糖、120 g/L果糖、6 g/L檸檬酸、6 g/L DL-蘋果酸、300 mg/L的酵母可同化氮源(銨和氨基酸)、鹽、維生素和厭氧因子(15 mg/L麥角固醇、5mg/L油酸鈉和0.5 mL/L吐溫 80溶解于5 mL乙醇中)［8］。MS300培養(yǎng)基模擬了標準葡萄汁，但是不包括葡萄的品種香氣和沒有氣味的前體物質(zhì)。酵母接種量為106個/mL(在接種之前用0.9%的NaCl清洗除去表面營養(yǎng)成分)。發(fā)酵溫度控制在20℃;pH 3.5。每個實驗設(shè)計3個重復(fù)。

1.4.2 香氣物質(zhì)提取

精確量取8 mL酒樣放入15 mL的頂空瓶中，加入1 g NaCl，促進香氣成分的揮發(fā)，再加入30 μL內(nèi)標(4-甲基-2-戊醇)，立刻用PTFE/硅橡膠隔墊密封壓緊。當(dāng)溫度到達45℃時，用DVB/CAR/PDMS的萃取頭萃取50 min，進樣進行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.4.3 GC/MS條件

程序升溫為30℃保持1 min，以6℃/min升至100℃，以3℃/min升溫至200℃，以10℃/min升溫至210℃，保持3 min。進樣器溫度250℃;檢測器溫度250℃;無分流進樣。

電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度200℃;全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍:30～400 u。

1.4.4 香氣成分的定性與定量分析

定性分析:用氣相色譜-質(zhì)譜-計算機聯(lián)用儀進行分析鑒定。分析結(jié)果運用計算機譜庫(NIST08和WILEY7)進行初步檢索及資料分析，再結(jié)合文獻進行人工譜圖解析，確認香氣物質(zhì)的各個化學(xué)成分。

定量分析:采用內(nèi)加標準法進行定量。

1.4.5 酒樣的感官分析

不同酵母發(fā)酵的酒樣放在通風(fēng)良好、無任何氣味的房間內(nèi)，分別由專業(yè)人員采用定量描述分析法(QDA)進行酒樣感官的定性和定量評價［9］。

實驗采用線性標度為評分標尺，即在1條10 cm線段上面標記出能代表某感官性質(zhì)強度或數(shù)量的位置，線段最左端代表“沒有”或者“0”，最右端代表“最大”或者“最強”。用直尺把每種強度轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的數(shù)值，然后輸入計算機進行分析。

感官評定人員各自對樣品進行品評，然后獨立記錄能反映酒樣感官特征的不同參數(shù)(即描述詞匯)。由實驗小組組長匯總并分類全部詞匯，與小組全體人員共同討論，確定最終的描述詞匯(花香、果香、甜味、酵母味、刺激味、脂肪味、酸味)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵參數(shù)

商業(yè)酵母菌株 RC212、D254、EC1118和 CY3079分別在20℃條件下發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后乙醇體積分數(shù)、殘?zhí)?、總酸、揮發(fā)酸和pH值測定結(jié)果見表1。各酒樣pH均為3.4。酵母D254具有較高的揮發(fā)酸水平(0.58 g/L)，而酵母 EC1118揮發(fā)酸含量最低，為0.46 g/L。各酒樣殘?zhí)蔷陀? g/L，其中D254具有較低的殘?zhí)呛?3.54 g/L)。RC212和EC1118酒樣具有較高的總酸含量，分別為9.13和9.11 g/L。各酵母發(fā)酵酒樣乙醇體積分數(shù)相差不大，RC212和D254乙醇體積分數(shù)為13.9%，比EC1118和CY3079酒樣高0.1度。

表1 不同商業(yè)酵母菌株20℃條件下的發(fā)酵參數(shù)

2.2 酵母香氣物質(zhì)GC-MS分析

對表2中酵母發(fā)酵的酒樣進行香氣物質(zhì)的定性定量分析發(fā)現(xiàn)，4種酵母自身合成的香氣物質(zhì)種類沒有差別，共有19種，主要包括9種酯、4種高級醇和6種酸。酵母D254合成的香氣物質(zhì)總量為1 174.72 mg/L，在4株酵母中香氣物質(zhì)合成量最高;酵母CY3079和EC1118合成的香氣物質(zhì)總量相差不大，分別為1 066.16 mg/L和1 014.32 mg/L;酵母RC212合成的香氣物質(zhì)總量為987.96 mg/L，低于其他3株酵母。

高級醇是酵母代謝的主要香氣物質(zhì)，這類物質(zhì)主要通過酵母的氨基酸合成和分解代謝途徑生成［10］。研究表明，正丙醇(酒精味)、異丁醇(酒精味)、異戊醇(苦味、雜醇味、刺激味)和2-苯乙醇(花香或玫瑰花香)是酵母合成的主要高級醇。在這4種醇中，異戊醇是主要的高級醇，約占高級醇總量的50%左右。CY3079菌株高級醇生成量最高(501.66 mg/L)，其中異戊醇生成量為259.12 mg/L;D254和RC212次之，異戊醇生成量分別為238.20和223.33 mg/L;EC1118菌株高級醇的生成量最低(453.47 mg/L)，異戊醇生成量為238.70 mg/L。異丁醇檢測結(jié)果表明，D254生成量最高(164.55 mg/L)，EC1118生成量最低(119.06 mg/L)。RC212具有較高的正丙醇生成能力(42.25 mg/L)。2-苯乙醇的生成量在各菌株中差別不大，均在60 mg/L左右。

由表2可以看出，酸類物質(zhì)在總香氣物質(zhì)中含量最高，乙酸為主要組分。D254酵母具有較高的產(chǎn)酸能力，乙酸生成量為628.66 mg/L;菌株 CY3079和EC1118產(chǎn)酸能力差別不大，其中乙酸生成量分別為507.28 mg/L和502.00 mg/L;菌株RC212具有較低的產(chǎn)酸能力，乙酸生成量為471.26 mg/L。不同酵母菌株中鏈脂肪酸生成量不同。雖然C6－C10脂肪酸通常與不好的氣味相關(guān)，但是它們對葡萄酒的香氣平衡性非常重要［11］。菌株 EC1118具有較高的辛酸(1.81 mg/L)、己酸(1.78 mg/L)和癸酸(1.07 mg/L)的合成能力，而菌株D254的異戊酸(0.94 mg/L)和異丁酸(2.16 mg/L)合成能力較強。這類酸的出現(xiàn)主要與酒的果香、奶酪、脂肪和酸味有關(guān)［12］。

表2 不同酵母菌株酒樣的香氣物質(zhì)濃度(mg/L，n=3)

本研究中4株酵母均表現(xiàn)出了較高的酯類物質(zhì)的生成能力。由表2可以看出，酵母合成的酯類物質(zhì)主要包括9種。其中乙酸乙酯(愉悅的、甜的水果香)是酵母合成的主要酯類。菌株D254乙酸乙酯的生成量最高(54.16 mg/L)，RC212最低(40.93 mg/L)。其他酯類主要包括:乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和月桂酸乙酯。這些酯對葡萄酒香氣中的花香和果香貢獻非常大［1］。菌株D254總酯的生成量最大(56.79 mg/L)，比菌株 RC212(42.66 mg/L)高 14.13 mg/L。EC1118總酯生成量居中，但是具有較高的乙酸-2苯乙酯(玫瑰花香)生成能力(0.54 mg/L)。

2.3 酒樣的感官分析

品評員分別對各酒樣從7個感官特性進行了定量描述分析。其中的描述性詞匯是評價小組按照已定義的感官特性來識別酒樣給人的感覺。從圖1可以看出，各酵母在相同的感官特性上所表達的每種特性的強度不同。菌株EC1118發(fā)酵的酒樣花香和甜味比較明顯，具有較低的刺激性。CY3079菌株刺激性比較大，RC212次之，這可能與高級醇含量高低有關(guān)。菌株D254具有較突出的果香，酸味也高于其他菌株，這可能與酒樣中含有較高濃度的酯類和乙酸有關(guān)。各菌株之間脂肪味和酵母味差別不大。

圖1 各酵母菌株的QDA數(shù)據(jù)蜘蛛網(wǎng)形圖

3 結(jié)論

通過對4株商業(yè)酵母CY3079、D254、EC1118和RC212香氣成分的定性定量分析表明，酵母自身合成的香氣物質(zhì)有19種，主要包括9種酯、4種高級醇和6種酸。有不同酵母菌株香氣物質(zhì)合成存在很大差別。CY3079具有較高的高級醇生成能力，其中異戊醇和2-苯乙醇的合成均高于其他酵母菌株。D254酵母具有較高的酯類和揮發(fā)酸類合成能力，其中乙酸乙酯和乙酸對酵母D254總酯和總揮發(fā)酸的含量貢獻較大。EC1118高級醇生成量最低，但是具有較高的乙酸-2-苯乙酯生成能力。RC212具有較低的酯類和揮發(fā)酸的生產(chǎn)能力，高級醇的生成量居中。

感官品評試驗表明，菌株D254的果香和酸味比較明顯。CY3079酒樣的刺激性比較大。EC1118具有比較突出的花香。RC212香氣濃郁度適中，沒有明顯的刺激味。

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