雙菌分步發(fā)酵混糟制水產(chǎn)飼料工藝*

張健，張文學(xué)，龍秀瓊，游玲，林娜，孫傳澤，劉小彬

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院/宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓，644005)2(四川大學(xué)輕紡與食品工程學(xué)院，四川成都，610065)3(宜賓敘府酒業(yè)，四川宜賓，644006)4(重慶啤酒集團(tuán)宜賓分公司，四川，宜賓，644000)

啤酒糟是啤酒廠原料糖化后產(chǎn)生的副產(chǎn)物，而白酒丟糟是原料經(jīng)過長時(shí)間發(fā)酵后的副產(chǎn)物。因此白酒丟糟具有大量菌體殘骸與代謝產(chǎn)物，更富有復(fù)雜的生長因子。啤酒糟與白酒糟以干物質(zhì)計(jì)約含蛋白質(zhì)25%(文中未注明均指質(zhì)量分?jǐn)?shù))與15%、含粗纖維15%與21%、含脂肪或類脂約6%，還含有多種維生素和十多種氨基酸等組分［1－2］。鑒于酒糟有較豐富的物質(zhì)成分與低成本，研究人員對(duì)于酒糟再利用與回收研究已開展了大量的工作。如利用酒糟生產(chǎn)食用菌、飼料、沼氣、酒精、肥料及制取高附加值產(chǎn)品(如制取粗酶制劑)和單細(xì)胞蛋白飼料(主要是酵母)［3－4］。

光合菌(photosynthetic bacteria，簡稱 PSB)富含蛋白質(zhì)(60%以上)、脂肪、可溶性糖類、胡蘿卜素、維生素B及16種氨基酸，還含有輔酶Q10(coenzyme)、抗病毒物質(zhì)(antibiotic)與促生長因子等。光合菌生命力極強(qiáng)、營養(yǎng)要求低、生長繁殖快、無毒害、無副作用，目前已廣泛應(yīng)用在養(yǎng)殖、種植、醫(yī)藥、環(huán)保與化工等各個(gè)行業(yè)［5－6］。另外，除增加營養(yǎng)、降低飼料系數(shù)外，光合菌還可起到刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)消化和抗病能力，促進(jìn)機(jī)體生長的作用［6］。但由于光合菌大多采用液態(tài)培養(yǎng)，因此在養(yǎng)殖業(yè)的運(yùn)用中存在制品不好保藏與運(yùn)輸，且含大量培養(yǎng)基成分，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境不利［7］;如若將保藏菌種現(xiàn)場使用，存在需周期進(jìn)行擴(kuò)培的不便。

采用綠色木霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維原料制取酶或飼料已有較多的報(bào)道［8－9］。在飼料應(yīng)用方面，由于蛋白質(zhì)含量提升不高或纖維素含量降低不夠，致使木霉發(fā)酵飼料在應(yīng)用上無論深度與廣度上均存在局限?，F(xiàn)有研究報(bào)道了以沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)分別對(duì)白酒丟糟與啤酒糟固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化制取高蛋白飼料的研究［10－11］。但白酒丟糟經(jīng)過酶降解后經(jīng)光合菌轉(zhuǎn)化，還存在纖維素含量較高達(dá)不到魚飼料一般標(biāo)準(zhǔn)的缺陷［10］。而采用纖維素酶降解啤酒糟，雖然纖維素與蛋白質(zhì)含量能達(dá)到魚飼料的一般標(biāo)準(zhǔn)［11］，但成本較高。利用綠色木霉、光合菌兩步發(fā)酵混糟制取固態(tài)魚飼料，目前未見相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)利用白酒丟糟含有豐富復(fù)雜的生長因子，把啤酒糟與白酒丟糟結(jié)合起來，把綠色木霉與光合菌結(jié)合起來，對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行研究與串聯(lián)，為制備高蛋白、低纖維素的活性光合菌魚飼料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

光合菌(PSB):在重慶啤酒集團(tuán)宜賓分公司的糖化車間啤酒糟排水溝中分離得到，鑒定為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。綠色木霉(Trichoderma viride):購于中國普通微生物菌種保藏中心，編號(hào)為 3.3711。光合菌種子培養(yǎng)基［12］:MgSO4·7H2O(0.2 g)、NH4Cl(1 g)、Na2CO3(4 g)、K2HPO4(0.3 g)、NaCl(0.5 g)、CH3CH2OH(3 g)、蛋白胨(1.5 g)、酵母膏(1 g)、H2O(定容至1 000 mL)。綠色木霉活化培養(yǎng)基:PDA固態(tài)培養(yǎng)基(土豆汁200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL)。

1.2 原料與主要試劑

啤酒糟:重慶啤酒宜賓分公司提供(80℃干燥成干糟)，水分 9.8%，粗蛋白質(zhì) 24.7%(真蛋白17.4%)，粗纖維 15.5%，粗脂肪 5.9%，粗灰分3.9%，總磷0.7%;白酒丟糟:四川宜賓敘府酒業(yè)提供(80℃干燥成干糟)，水分10.1%，粗蛋白質(zhì)14.3%(真蛋白11.9%)，粗纖維21.6%，粗脂肪5.5%，粗灰分14.4%，總磷0.5%。

氨水(AR，成都市科龍化工試劑廠);H3PO4(AR，成都市科龍化工試劑廠);氮?dú)?工業(yè)級(jí)，成都旭源化工有限責(zé)任公司)。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)流程

(1)鮮糟干燥與檢測。分別從啤酒廠、白酒廠提取新鮮酒糟置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，80℃恒溫至恒重得干糟，并將兩種干糟粉碎過40目篩，測定兩種酒糟的主要成分。

(2)酒糟預(yù)處理。以一定比例混合兩種干酒糟，稱取500 g干混糟于不銹鋼耐壓容器中，加入500 mL 0.8%(v/v)氨水拌勻，密閉沸水浴(100℃)處理2 h，得氨化糟;用1%H3PO4調(diào)節(jié)氨化糟pH至一定值，接入綠色木霉發(fā)酵劑，在圖1的發(fā)酵裝置中，采用二階段變溫發(fā)酵方法得綠色木霉發(fā)酵糟。80℃恒溫至恒重得干木霉發(fā)酵糟，測定其纖維素含量。用0.8%(v/v)氨水調(diào)節(jié)綠色木霉發(fā)酵糟pH至7.2，置于電爐上保持微沸蒸煮30 min，冷卻至室溫得蒸煮糟。

(3)光合菌二次發(fā)酵［10－11］。按10%接種量接種光合菌發(fā)酵劑于蒸煮糟中，并加入無菌水，控制加水比1∶9(干糟g∶水g)，在光合菌厭氧發(fā)酵裝置中通入過量氮?dú)庠斐蓞捬鯒l件，在光照強(qiáng)度1 000 Lx、溫度30℃、料層厚度4 cm條件下進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，每日觀察酸度變化，用0.8%(v/v)氨水調(diào)節(jié)pH至7.2，發(fā)酵5天取樣，得發(fā)酵醪樣品。

(4)樣品檢測。將所得的發(fā)酵醪在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中80℃恒溫干燥至恒重，冷卻后測指標(biāo)。

圖1 綠色木霉通風(fēng)發(fā)酵裝置

1.3.2 發(fā)酵劑制備

將綠色木霉接種于PDA固態(tài)培養(yǎng)基上，于溫度30℃、4 d斜面活化3次。挑取單菌落轉(zhuǎn)接到三角瓶PDA液體培養(yǎng)基中，于28℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)4 d。后分出培養(yǎng)液按10%(w/w)接種量接種于已滅菌的250 g蒸煮混糟中(啤酒干糟g∶白酒丟干糟g為1∶1)，采用圖1的裝置進(jìn)行第1次擴(kuò)培，通氣量45 mL/min，溫度28℃;第2、3次擴(kuò)培方法與第1次相同，以第3次擴(kuò)培后的糟液作為木霉發(fā)酵劑。光合菌發(fā)酵劑制備與發(fā)酵方法同文獻(xiàn)［10－11］，而采用的擴(kuò)培蒸煮糟為混糟［m(啤酒干糟)∶m(白酒丟干糟)為1∶1］。

1.3.3 綠色木霉發(fā)酵試驗(yàn)

綠色木霉通風(fēng)發(fā)酵罐(圖1)由不銹鋼圓筒體(直徑10 cm，高12 cm)、不銹鋼上蓋板(加有螺栓)、中空不銹鋼通氣管、下部空氣分布盤與上部空氣導(dǎo)出管組成。當(dāng)混糟在筒體中發(fā)酵時(shí)，料層厚度取9 cm。

按試驗(yàn)流程，綠色木霉發(fā)酵階段有9個(gè)因素需要確定:干糟比(啤酒干糟與白酒干丟糟的質(zhì)量比)，料水比(干混糟與水的質(zhì)量比)、木霉接種量(%，w/w)、起始pH、第1階段發(fā)酵溫度(℃)、第1階段發(fā)酵時(shí)間(d)、第2階段發(fā)酵溫度(℃)、第2階段發(fā)酵時(shí)間(d)、通風(fēng)量(mL/min)。以干木霉發(fā)酵糟纖維素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Plackett-Burman法篩出顯著因子，再采用最陡爬坡法確定篩出因素的中心點(diǎn)，以此中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)(central composite design)的響應(yīng)曲面分析。將得到的綠色木霉發(fā)酵優(yōu)化參數(shù)重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，進(jìn)行光合菌二次發(fā)酵，分析飼料的6個(gè)指標(biāo)。

1.3.4 分析方法

酒糟、發(fā)酵干混糟真蛋白含量采用沉淀法［13］與凱氏定氮法［14］;酒糟與發(fā)酵干混糟粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、總磷、粗纖維、水分測定分別按GB/T 6432－1994、GB/T 6433 － 2006、GB/T 6438 － 2007、GB/T 6437－2002、GB/T 6434－2006、GB/T 6435－2006進(jìn)行。Plackett-Burman設(shè)計(jì)、中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Design)以及響應(yīng)曲面法采用Design expert軟件進(jìn)行(版本8.05b)。每組試驗(yàn)重復(fù)2次，以平均值做為分析數(shù)據(jù)，樣品之間顯著性差異采用SPSS(版本19.0)軟件檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯著因子篩選

綠色木霉發(fā)酵階段的9個(gè)因素按Plackett-Burman法(設(shè)立了2個(gè)空白項(xiàng))確定的高低水平與試驗(yàn)結(jié)果見表1。用Design expert軟件進(jìn)行結(jié)果分析表明，干糟比、料水比、第1階段發(fā)酵時(shí)間(d)與通風(fēng)量(mL/min)是在9個(gè)因素中的4個(gè)顯著影響因子(P＜0.05)，而其他因素的影響不顯著(P＞0.05)，而所用模型是有顯著意義的(P＜0.05)。因此，干糟比、料水比、第1階段發(fā)酵時(shí)間與通風(fēng)量由于原料、發(fā)酵工藝變化，存在較明顯的研究不足，需要進(jìn)一步深入研究與優(yōu)化。

表1 Plackett-Burman法試驗(yàn)結(jié)果

2.2 中心水平的確定

根據(jù)Plackett-Burman法試驗(yàn)結(jié)果，木霉接種量(%，w/w)、起始pH、第1階段發(fā)酵溫度(℃)、第2階段發(fā)酵溫度(℃)、第2階段發(fā)酵時(shí)間(d)5因素取Plackett-Burman設(shè)計(jì)中的中值水平，干糟比、料水比、第1階段時(shí)間(d)與通風(fēng)量(mL/min)4因素的最陡爬坡法設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

鑒于在Plackett-Burman法試驗(yàn)中有干糟比、一階段時(shí)間與通風(fēng)量3因素的模型系數(shù)均為負(fù)數(shù)，要使纖維素含量降低，采用這3因素均正向增大的爬坡配組設(shè)計(jì);而因素料水比的模型系數(shù)為正數(shù)，采用此因素正向減少的爬坡配組設(shè)計(jì)。從表2可以看出，當(dāng)干糟比為(2∶1)～(3∶1)、料水比為(1∶2)～(1∶3)、1 階段時(shí)間4～5 d、通風(fēng)量70～90 mL/min時(shí)，木霉發(fā)酵干混糟纖維素含量顯著降低(P＜0.05)，這4個(gè)因素分別取2.5∶1(g∶g)、1∶2.5(g∶g)、4.5 d 與 80 mL/min做為進(jìn)一步中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心水平。

2.3 中心組合設(shè)計(jì)及其響應(yīng)曲面分析

根據(jù)最陡爬坡法確定的中心點(diǎn)，4因素5水平的中心組合設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果見表3(α水平取2)。為便于方程處理，干糟比與料水比(轉(zhuǎn)化為水料比，水g∶干混糟g)直接用數(shù)字值表示。

表3 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

得到的二次線性回歸方程為:

式中，Y—纖維素含量(%);A—干糟比(啤酒干糟g∶白酒丟干糟g);B—水料比(水g∶干混糟g);C—一階段時(shí)間(d);D—通風(fēng)量(mL/min)。該模型顯著性P(prob＞F)為0.015 4＜0.05，相關(guān)系數(shù)R2為0.751 3，失擬項(xiàng)P(prob＞F)為0.064 6＞0.05不顯著，因此方程具有顯著意義，可做為響應(yīng)值的預(yù)測。另外，通過方差分析，方程中D、A2、B2、D2各項(xiàng)具有顯著性(P＜0.05)，而其余項(xiàng)不顯著。

圖2給出了響應(yīng)面曲面圖與相應(yīng)等高線。從中可以看到，當(dāng)干糟比A、水料比B、一階段時(shí)間C與通風(fēng)量D在考察水平范圍內(nèi)，可使響應(yīng)面出現(xiàn)“兜底”。通過對(duì)方程優(yōu)化，當(dāng)干糟比A為2.67，水料比B為2.88，1階段時(shí)間 C為4.82 d、通風(fēng)量 D為83.16 mL/min時(shí)，綠色木霉發(fā)酵干糟的纖維素含量可為最低預(yù)測值10.2511%。用以上4因素優(yōu)化參數(shù)，重新進(jìn)行木霉發(fā)酵2次，實(shí)際發(fā)酵干糟的纖維素含量為(9.9±0.3)%，均值比預(yù)測值低。但若考慮預(yù)測值的相對(duì)偏差(取平均值0.4%)，這種差別實(shí)際上無顯著意義(P＜0.1)。另外，鑒于在建模過程中未考慮各項(xiàng)因素嚴(yán)重的交互作用，因此也可能造成實(shí)測值與預(yù)測值之間的差別。

2.4 光合菌二次發(fā)酵

按以上綠色木霉試驗(yàn)結(jié)果的優(yōu)化組合，重新按1.3.1節(jié)步驟進(jìn)行光合菌二次發(fā)酵，發(fā)酵后干混糟化學(xué)成分結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵干混糟化學(xué)成分與魚飼料標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比(%，w/w)

從發(fā)酵干混糟蛋白(真蛋白38.4%，粗蛋白43.9%)、纖維素、水分、粗脂肪、總磷、灰分等6個(gè)含量指標(biāo)來看，啤酒糟與白酒丟糟的混合物經(jīng)過光合菌的轉(zhuǎn)化后，已達(dá)到我國草魚魚種飼料標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)成分要求，而發(fā)酵干混糟粗蛋白質(zhì)含量已達(dá)到了草魚魚苗對(duì)飼料蛋白質(zhì)含量要求。發(fā)酵干糟的纖維素含量已經(jīng)從綠色木霉發(fā)酵后的9.9%降低至5.9%，如進(jìn)一步降低發(fā)酵干糟纖維素含量1%，這6個(gè)指標(biāo)即可達(dá)到草魚魚苗飼料的標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)酵干混糟與羅非魚飼料標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比來看，6項(xiàng)指標(biāo)含量也已達(dá)到了羅非魚魚種飼料標(biāo)準(zhǔn)，纖維素含量與魚苗標(biāo)準(zhǔn)還有3%的差距。另外，白酒丟糟經(jīng)過木霉與光合菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化，除蛋白質(zhì)大量增加外，粗脂肪增加了2.4%，總磷含量增加了2倍多。

圖2 響應(yīng)曲面圖

3 討論

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，綠色木霉在以純啤酒糟做發(fā)酵基質(zhì)時(shí)生長不足，而以純白酒丟糟做發(fā)酵基質(zhì)時(shí)能大量生長。因此，以啤酒糟為主要原料時(shí)，考慮添加白酒丟糟作為輔料，促進(jìn)綠色木霉大量生長是使原料中纖維素降解的首要前提。從本綠色木霉半固態(tài)通風(fēng)發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果來看，第1階段30℃低溫發(fā)酵主要促進(jìn)綠色木霉生長與產(chǎn)酶，在綠色木霉適合溫度范圍［15－16］;第2 階段提高溫度至50 ℃發(fā)酵2.5 d，此為纖維素酶作用適合的溫度與作用時(shí)間范圍［17］;pH5.0在木霉生長及其分泌的纖維素酶作用的合適酸度范圍［18］，這幾個(gè)因素即使在本工藝條件下基本與其它文獻(xiàn)研究結(jié)果相符，因此即使原料與工藝發(fā)生一定變化，綠色木霉及其酶特性基本未發(fā)生顯著變化。

綠色木霉液態(tài)通風(fēng)深層發(fā)酵研究方面，文獻(xiàn)報(bào)道一定量的氮源或碳氮比是綠色木霉生長與分泌一定濃度纖維素酶的重要前提［19－20］，而 Malik 等［19］發(fā)現(xiàn)，硫酸銨是一種對(duì)綠色木霉發(fā)酵較好的氮源，但本研究采用氨水浸泡再用磷酸調(diào)節(jié)酸度，試驗(yàn)證明既補(bǔ)充了氮源也提高了飼料總磷含量。在綠色木霉固態(tài)發(fā)酵方面，Kiro［21］用一種淺盤發(fā)酵方式用綠色木霉轉(zhuǎn)化經(jīng)堿處理的麥秸提高飼用價(jià)值與產(chǎn)纖維素酶，但這種淺盤發(fā)酵方法不便于大規(guī)模生產(chǎn)，而且蛋白提升不高、纖維素降低不夠使飼料應(yīng)用不廣。Iyayi和Ad-erolu［9］利用綠色木霉固態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化啤酒糟(BDG)14 d以提高其飼用價(jià)值，可使蛋白質(zhì)含量提高87%與降低粗纖維含量35%，但未說清發(fā)酵工藝，而且按這種蛋白質(zhì)增加率與纖維素降解率也達(dá)不到水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)飼料要求。張健等［10］采用纖維素酶對(duì)白酒丟糟先進(jìn)行酶解，再進(jìn)行光合菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化，雖然一定程度上提高了飼料飼用價(jià)值，但其飼料纖維素含量仍然較高。綠色木霉發(fā)酵在本試驗(yàn)條件下取得了比單純加酶好的降解效果，除跟混糟的使用降低了原料纖維素含量有關(guān)，也可能跟綠色木霉在生長過程中破壞了木質(zhì)纖維原料中纖維素、木質(zhì)素、半纖維素之間的締合作用，從而使分泌出的纖維素酶增加了可及度，產(chǎn)生好的降解效果有關(guān)。另外，有大量文獻(xiàn)研究了混菌發(fā)酵方式(其中有綠色木霉)轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維原料的工藝［22－23］，但目前也未見顯著的應(yīng)用進(jìn)展。

本試驗(yàn)首先加入氨水進(jìn)行原料預(yù)處理再用磷酸調(diào)節(jié)合適酸度，使綠色木霉的生長、纖維素酶的分泌與飼料價(jià)值的提升等綜合在一起;采用通風(fēng)半固態(tài)發(fā)酵方式，使綠色木霉發(fā)酵縮短了發(fā)酵時(shí)間而使粗纖維含量降低了42%，進(jìn)而再采用光合菌二次發(fā)酵，可使真蛋白質(zhì)升高達(dá)139%，纖維素下降66%，因此本發(fā)酵工藝具有較強(qiáng)的工業(yè)化應(yīng)用前景，為進(jìn)一步開發(fā)出“酒糟光合菌活性生物蛋白飼料”奠定了重要的基礎(chǔ)。當(dāng)然擴(kuò)大光合菌發(fā)酵糟在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的關(guān)鍵因素，還需要進(jìn)一步降低粗纖維含量;對(duì)微量元素、維生素與氨基酸進(jìn)行分析與調(diào)整;研究后處理工藝;研究飼料對(duì)魚生理的影響與飼料應(yīng)用品質(zhì);探討工業(yè)化生產(chǎn)路徑等。

4 結(jié)論

(1)采用熱氨水浸泡、綠色木霉降解等對(duì)啤酒糟與白酒丟糟混糟進(jìn)行預(yù)處理，再利用沼澤紅假單胞菌厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化混糟，提高了混糟的水產(chǎn)飼用價(jià)值，可制取質(zhì)量較高的魚飼料。

(2)啤酒干糟與白酒丟干糟之比為2.67∶1(g∶g)，料水比為1∶2.88(干混糟g∶水g)、接種量為9.5%(w/w)、發(fā)酵初始pH為5.0、發(fā)酵前期溫度30℃維持4.82 d、發(fā)酵后期50℃維持2.5 d、料層厚度為9 cm、通風(fēng)量83.2 mL/min時(shí)，綠色木霉降解混糟的效果好，粗纖維素含量可從17.2%(w/w)下降至9.9%(w/w)。

(3)經(jīng)光合菌第2次發(fā)酵后，干混糟粗蛋白含量可達(dá)43.9%(w/w)(真蛋白含量38.4%)、纖維素含量5.9%(w/w)、粗脂肪8.1%(w/w)、粗灰分7.8%(w/w)、總磷1.3%(w/w)、水分含量 9.8%(w/w)，6項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到“中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)”羅非魚魚種配合飼料化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)(SC/T1025－2004)。

總之，啤酒糟與白酒丟糟的混糟經(jīng)過綠色木霉與光合菌兩次發(fā)酵轉(zhuǎn)化，更加適宜于作為魚飼料，提高了啤酒糟與白酒丟糟的飼用價(jià)值。

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