β-七葉皂甙鈉對腸缺血再灌注損傷后腸粘膜屏障功能、形態(tài)學(xué)變化的影響＊

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院局解手術(shù)學(xué)教研室（延安716000） 朱文俠 王航輝 韓振奎

腸缺血再灌注損傷（Intestinal ischemia reperfusion injury，IIRI）是常見的臨床圍手術(shù)期難題。IIRI可引起伴通透性增加的腸上皮屏障功能障礙與細菌易位。另外，腸被認為是炎性細胞因子引起腸源性全身炎癥反應(yīng)綜合征、敗血癥、多器官功能衰竭進展的根源［1，2］，因此保護腸粘膜屏障日益受到重視。腸缺血再灌注損傷后，缺氧、內(nèi)毒素、酸中毒等多種因素影響腸粘膜屏障（Intestinal mucosal barrier）的結(jié)構(gòu)和功能。β-七葉皂甙鈉（Sodium aescinate，SA）為純天然植物提取物，是從中藥娑羅子的干燥成熟果實中提取的二萜皂甙鈉鹽，最大限度地保存了生物活性。研究證明［3～7］：β-七葉皂甙鈉具有抑制炎癥、清除自由基、抗?jié)B出、抗水腫、抗凋亡，改善微循環(huán)等作用。本研究旨在探索β-七葉皂甙鈉對大鼠腸缺血再灌注損傷早期腸粘膜屏障功能和形態(tài)學(xué)研究，進一步探討其保護腸粘膜屏障的作用及可能機制。

材料和方法

1 實驗動物及分組 成年雄性SD大鼠54只，體重為170～180g，隨機分為3組：假手術(shù)組和模型組、β-七葉皂甙鈉（山東煙臺綠葉制藥股份有限公司）治療組。

2 方 法

2.1 制作大鼠腸缺血-再灌注損傷模型：麻醉大鼠，作腹正中切口，分離出腸系膜上動脈（Superior mesenteric artery，SMA）。假手術(shù)組只分離SMA，不結(jié)扎；模型組在SMA根部用無創(chuàng)傷血管夾夾閉，阻斷45min后松夾，恢復(fù)血流后觀察24h；治療組同前，于缺血前30min對每只大鼠行尾靜脈推注β-七葉皂甙鈉（10mg／kg）。假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。再灌注24h后處死動物，取回盲部10cm以上腸管，固定，包埋，4℃保存。一部分測濕／干重比值；一部分光學(xué)顯微鏡觀察小腸組織的損傷程度。手術(shù)過程中，腹腔內(nèi)滴加生理鹽水5ml。

2.2 腸組織濕／干比值的測定：取小腸組織，吸干表面水分后稱重量為濕重（W）；然后將組織置入70℃恒溫電烤箱中反復(fù)烘烤72h至恒重，稱重量為干重（D）。計算濕重與干重比值（W／D），表示組織水腫形成情況，間接反映毛細血管的通透性。

2.3 腸組織血管通透性檢測：根據(jù)滲入組織中的伊文氏藍染料量評價血管的通過性［8］。再灌注前2 min，于股靜脈注射2%伊文思藍（Evans Blue，EB）2 mg／kg，再灌結(jié)束后取回盲部10cm以上腸管約5cm剪開，37℃干燥24h，稱重后用3ml甲酰胺室溫浸泡24h提取伊文氏藍。620nm處繪制伊文氏藍的標準曲線，結(jié)果以μg／g腸組織表示。

2.4 透射電鏡觀察腸粘膜屏障變化：再灌注24 h后取腸組織，將回腸標本修成1mm×1mm×3 mm大小，固定，脫水、浸透、包埋、超薄切片，透射電鏡觀察（TOSHI-BA，Japan）。

結(jié) 果

1 腸粘膜結(jié)構(gòu)的Chiu’s評分［9］評分標準見表1。光鏡下假手術(shù)組腸粘膜形態(tài)結(jié)構(gòu)完整（圖1）；模型組腸粘膜和粘膜下層充血、水腫、糜爛，中性粒細胞浸潤（圖2）；治療組亦可見上述表現(xiàn)，但損傷程度較模型組明顯減輕（P＜0.05）（圖3）。Chiu’s評分模型組的最高、假手術(shù)組最低。治療組相對模型組明顯降低（P＜0.05）（見表2）。

表1 腸粘膜損傷評分分級

表2 大鼠腸組織Chiu評分、濕／干重比值及伊文思藍含量（n＝6，±s）

表2 大鼠腸組織Chiu評分、濕／干重比值及伊文思藍含量（n＝6，±s）

注：模型組和β-七葉皂甙鈉治療組比較＊P＜0.05，假手術(shù)組和β-七葉皂甙鈉治療組比較＊＊P＜0.05

分組 Chiu’s評分 濕／干重比值（%）伊文思藍含量（μg／g）4.89±0.61 103.39±10.27模型組 4.0±0.35＊＊ 6.46±0.27＊ 285.46±21.09＊β-七葉皂甙鈉治療組 2.3±0.26 5.19±0.51＊ 140.25±19.18假手術(shù)組 0±0.000＊＊

2 各組大鼠腸濕／干重比值 如表2所示。β-七葉皂甙鈉能明顯降低腸缺血再灌注大鼠的腸濕／干重比值，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）。

3 β-七葉皂甙鈉對大鼠腸粘膜屏障通透性的影響 腸缺血再灌注后，模型組及β-七葉皂甙鈉組腸組織EB含量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；而β-七葉皂甙鈉組腸組織EB含量較模型組明顯降低（P＜0.05），提示β-七葉皂甙鈉對腸粘膜屏障有較好的保護作用（表2）。

4 β-七葉皂甙鈉對腸粘膜組織細胞超微結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組腸粘膜形態(tài)完整，緊密連接和橋粒結(jié)構(gòu)清晰，可見大量排列整齊的微絨毛（圖1）。模型組腸粘膜結(jié)構(gòu)紊亂，絨毛破損，緊密連接結(jié)構(gòu)模糊、腫脹，微絨毛大量脫落、斷裂（圖2）；而β-七葉皂甙鈉組腸粘膜破壞減輕，緊密連接結(jié)構(gòu)大致可見，腫脹緩解（圖3）。

圖1 假手術(shù)組大鼠正常腸粘膜結(jié)構(gòu)（H＆E×200）

圖2 模型組大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)破壞（H＆E×200）

圖3 治療組大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)（H＆E×200）

討 論

腸粘膜屏障是腸道防御機制中最重要的環(huán)節(jié)，主要由機械屏障、生物屏障、免疫屏障［10，11］及化學(xué)屏障構(gòu)成，其中機械屏障是腸粘膜屏障的根本。腸道機械屏障由腸粘膜表面的粘液層、腸上皮層及其密連接、上皮基底膜、粘膜下固有層等組成。廣義的機械屏障還包括腸道的運動功能，腸蠕動將腸內(nèi)食物殘渣向遠側(cè)推進，防止細菌在鄰近腸粘膜的長時間滯留，減少細菌穿過粘液層到達上皮的機會，起“腸道自潔作用”。機械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是腸粘膜上皮細胞細胞與細胞之間完整的連接。腸缺血再灌注等應(yīng)激狀態(tài)下，其結(jié)構(gòu)完整性和連續(xù)性被破壞，致使機械屏障作用減弱［12］。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠腸粘膜的光鏡、電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，腸粘膜組織結(jié)構(gòu)紊亂、破壞。治療組大鼠使用中藥β-七葉皂甙鈉后，光鏡下組織病理、電鏡下細胞超微結(jié)構(gòu)的觀察顯示腸粘膜組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，表明其對腸粘膜屏障組織結(jié)構(gòu)有較好的保護作用。

圖4 假手術(shù)組大鼠正常腸粘膜上皮細胞（TEM×6600）

圖5 模型組大鼠腸粘膜上皮細胞凋亡（TEM×8900）

圖6 β-七葉皂甙鈉組大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)（TEM×8900）

腸道最主要功能是吸收營養(yǎng)、排出食物殘渣、細菌及其產(chǎn)物。這些功能的維持有賴于腸粘膜的連續(xù)性與屏障結(jié)構(gòu)的完整性。然而，在特定的病理狀態(tài)下，如腸缺血再灌注損傷，腸失去其屏障功能可導(dǎo)致全身性微生物感染甚至多器官功能衰竭［13，14］。實驗發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注24h后，滲漏到血管外的EB含量和腸組織濕／干重較假手術(shù)組明顯增加，與電鏡觀察到毛細血管周圍有大片水腫，共同提示腸粘膜屏障的通透性顯著增加，引起了血管源性腸水腫。此過程中腸機械屏障開放可能與腸組織的過度灌流、自由基形成有關(guān)。腸粘膜結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致其屏障功能減弱，通透性增加。使生理狀態(tài)下不能通透的物質(zhì)進入組織間隙，繼發(fā)血管源性腸水腫，進一步加重再灌注損傷。β-七葉皂甙鈉能攜帶長鏈脂肪酸進入線粒體參加β氧化，并且作為氧自由基抑制劑，能減輕氧化應(yīng)激、減少脂質(zhì)過氧化、抗凋亡［5，13］。應(yīng)用β-七葉皂甙鈉后，腸組織 EB含量和腸組織濕／干重減少，毛細血管周圍的水腫也減輕，提示β-七葉皂甙鈉在代謝紊亂時對腸的正常功能的維持起著重要的保護作用。

綜上所述，β-七葉皂甙鈉可以維護腸粘膜屏障的完整性和連續(xù)性，降低腸粘膜血管的通透性，進一步證實了β-七葉皂甙鈉對腸缺血再灌注損傷所致腸粘膜屏障的形態(tài)與功能具有保護作用，為其在腸粘膜屏障損傷中的防治提供了理論依據(jù)。β-七葉皂甙鈉對腸粘膜屏障保護作用的詳細機制仍有待進一步研究。

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