超聲輔助酶促己酸乙酯的合成

沈詠梅, 謝曉娜, 荀二娜, 王佳欣, 張 弘, 王 磊, 王 智

(1. 吉林大學(xué) a. 白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠; b. 分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; c. 第一臨床醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130021)

酶在非水反應(yīng)介質(zhì)中的催化作用是近年來(lái)酶工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[1]。雖然酶在非水相中的催化反應(yīng)具有許多優(yōu)點(diǎn)，但在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用卻很有限，這主要是由于酶在非水反應(yīng)介質(zhì)中活力較低，尋找能加快酶促反應(yīng)速度的方法迫在眉睫。近年來(lái)超聲技術(shù)在化學(xué)中得到迅速發(fā)展。在適宜的條件下超聲作用能極大地提高反應(yīng)速度，而這種技術(shù)在酶促反應(yīng)中的應(yīng)用最近才開始得到關(guān)注[2]。酶是一種比較容易變性的蛋白質(zhì)，微小的結(jié)構(gòu)改變可能會(huì)極大地降低酶的催化活性，因此選擇合適的反應(yīng)條件對(duì)超聲輔助的酶催化反應(yīng)顯得尤為重要[3～6]。

己酸乙酯作為濃香型白酒的主體風(fēng)味物質(zhì),是衡量白酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[7],市場(chǎng)需求量很大。目前主要利用酸催化法[8]制備；但化學(xué)法制備的產(chǎn)品質(zhì)量不高，同時(shí)酸催化還會(huì)產(chǎn)生大量廢液，造成環(huán)境污染。在前期研究工作中[9,10]，我們將來(lái)源于嗜熱性古細(xì)菌Aeropyum pernix K1的嗜熱脂肪酶APE1547固定在帆布上成功地催化制備了己酸乙酯。然而該方法合成速度較慢，反應(yīng)周期較長(zhǎng)。

本文以脂肪酶Bacillussubtilislipase(BSL2)在有機(jī)溶劑中催化合成己酸乙酯，重點(diǎn)考察了超聲條件對(duì)酶促合成反應(yīng)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津GC-14B型氣相色譜儀[GC, Econo-CAP SE54毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 mm),氫火焰檢測(cè)器;載氣N2(60 mL·min-1);進(jìn)樣室溫度200 ℃,檢測(cè)室溫度290 ℃;升溫程序:起始柱溫110 ℃,保留1 min,升溫速率15 ℃·min-1,最后溫度210 ℃,保留2 min;進(jìn)樣量2 μL]; KQ-250DE型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器(最大功率250 W,功率可調(diào)40%～100%,水浴控溫20 ℃～80 ℃); AP-400/150 W型全數(shù)字超聲波處理器(功率150 W，探頭直徑3 mm)。

所用試劑均為分析純。

1.2 BSL2的制備[11]

將工程菌BSL按接種量的1%接種于硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基(5 mL含有30 μg·mL-1)上,于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)20 h。再將其按1%的接種量接種于LB培養(yǎng)基(200 mL)上,于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)4 h;轉(zhuǎn)接到發(fā)酵LB培養(yǎng)基(2 L)上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600值，當(dāng)OD600達(dá)到0.8～1.0時(shí)，離心分離(8 000 rpm, 15 min),上清液(菌體)于-20 ℃冷凍過(guò)夜。取出于室溫自然融化，加入菌體9倍體積的50 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH 8.5)和溶菌酶[V(菌體) ∶V(溶菌酶)=1 ∶500],于4 ℃恒溫消化1.0 h。離心分離(4 ℃, 12 000 rpm, 20 min),上清液即為BSL2粗酶。

BSL2粗酶加40%硫酸銨溶液析出沉淀，離心分離(8 000 rpm, 15 min);上清液用70%硫酸銨溶液沉淀,離心分離(8 000 rpm, 15 min);棄上清液，沉淀用TNS-HCl緩沖溶液溶解,置透析袋中透析過(guò)夜，凍干得無(wú)色粉末BSL2，備用。

1.3 初始水活度(aw)的控制

通過(guò)直接在基本反應(yīng)體系中加入水合鹽控制aw。反應(yīng)體系的aw分別為0.06(LiBr), 0.11(LiCl), 0.24(AcOK), 0.33(MaCl2), 0.53[Mg(NO3)2], 0.75(NaCl)和0.97(K2SO4)。

1.4 BSL2催化合成己酸乙酯

在反應(yīng)瓶中依次加入正己烷(aw=0.53,硅藻土40 mg) 20 mL,120 mmol·L-1己酸和乙醇,BSL2 100 mg，置振蕩培養(yǎng)箱或超聲清洗器中于50 ℃反應(yīng)20 min。GC測(cè)定己酸轉(zhuǎn)化率,并計(jì)算反應(yīng)速度(μmol·g-1·min-1)。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)裝置的影響

首先比較了超聲探頭和超聲波清洗器對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，利用超聲清洗器產(chǎn)生的超聲對(duì)反應(yīng)具有明顯的促進(jìn)作用，反應(yīng)速度相對(duì)常規(guī)振蕩提高了約1.56倍；而利用超聲探頭產(chǎn)生的超聲則在相同反應(yīng)條件下大幅度降低了酶活。分析其原因，很可能是超聲作用能夠促進(jìn)底物和產(chǎn)物在反應(yīng)體系中的擴(kuò)散，增加底物與酶分子活性中心發(fā)生相互作用的幾率，從而大幅度提高反應(yīng)速度；另外一定強(qiáng)度的超聲作用能夠改善酶的“微環(huán)境”，優(yōu)化其空間構(gòu)象[12]，因此進(jìn)一步提高了其催化活性。與超聲波清洗器相比較，超聲探頭更容易與反應(yīng)體系中的酶分子發(fā)生直接接觸，從而導(dǎo)致酶分子變性失活。而超聲清洗器產(chǎn)生的超聲則需要通過(guò)反應(yīng)介質(zhì)的傳導(dǎo)作用才能夠作用于酶分子上，因此其破壞作用大幅度減弱，所以超聲清洗器對(duì)酶促反應(yīng)的促進(jìn)效果比較理想。

表 1 反應(yīng)裝置對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響*Table 1 Effect of reaction apparatus on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase

*反應(yīng)速度(μmol·g-1·min-1)定義：BSL2 1 g在1 min催化合成己酸乙酯的量(μmol);常規(guī)振蕩:150 rpm, 50 ℃;超聲水浴:連續(xù)超聲,150 W, 50 ℃; 超聲探頭:探頭離反應(yīng)液液面1 cm,連續(xù)超聲,150 W, 50 ℃

2.2 超聲方式的影響

在相同的反應(yīng)條件下，考察了超聲處理方式對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，相對(duì)常規(guī)振蕩，連續(xù)超聲和間歇超聲作用都明顯提高了反應(yīng)速度;其中間歇超聲更有利于促進(jìn)反應(yīng)，在間歇超聲(50 s/30 s)的作用下，反應(yīng)速度提高了3.9倍。連續(xù)超聲很可能對(duì)酶分子的空間構(gòu)象造成了一定的破壞，因此連續(xù)超聲的作用效果并不十分理想。而超聲預(yù)處理之所以不能大幅度提高酶活，其原因很可能是它不能促進(jìn)底物和產(chǎn)物在反應(yīng)體系中的擴(kuò)散，導(dǎo)致底物與酶分子活性中心發(fā)生相互作用的幾率仍然較低的緣故。

表 2 超聲方式對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響*Table 2 Effect of ultrasonic ways on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase

*超聲預(yù)處理:將含有BSL2 100 mg的正己烷(20 mL, aw=0.53,硅藻土40 mg)置超聲清洗器中進(jìn)行預(yù)處理(連續(xù)超聲,150 W, 50 ℃, 20 min),加底物反應(yīng);間歇超聲:在超聲清洗器中反應(yīng)，超聲50 s,間歇30 s(150 W, 50 ℃,總反應(yīng)時(shí)間20 min)

2.3 間歇超聲時(shí)間的影響

固定間歇時(shí)間30 s,在超聲清洗器中于50 ℃反應(yīng)20 min,其余反應(yīng)條件同1.4,考察超聲時(shí)間對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，間歇時(shí)間固定以后，反應(yīng)速度隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)大幅度提高;超聲時(shí)間為50 s時(shí)達(dá)到最大;進(jìn)一步延長(zhǎng)超聲時(shí)間，反應(yīng)速度開始下降。

固定超聲時(shí)間50 s,在超聲清洗器中于50 ℃反應(yīng)20 min,其余反應(yīng)條件同1.4,考察間歇時(shí)間對(duì)酶促酯合成己酸乙酯的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，隨著間歇時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)速度同樣呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，最適間歇時(shí)間為30 s。這可能是如果間歇時(shí)間太短，酶分子的空間構(gòu)象容易受到超聲作用的破壞，間歇時(shí)間越短，這種破壞程度越大。然而一旦間歇時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲促進(jìn)底物和產(chǎn)物在反應(yīng)體系中的擴(kuò)散效果就會(huì)大幅度減弱，因此對(duì)酶促合成己酸乙酯反應(yīng)的作用效果也不是十分理想。

Ultrasonic time/s圖 1 超聲時(shí)間對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響*Figure 1 Effect of ultrasonic time on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*固定間歇時(shí)間30 s,在超聲清洗器中于50 ℃反應(yīng)20 min,其余反應(yīng)條件同1.4

Intermission time/s圖 2 間歇時(shí)間對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響*Figure 2 Effect of intermission time on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*固定超聲時(shí)間50 s,其余同圖1

2.4 超聲功率的選擇

間歇超聲50 s/30 s,考察超聲功率對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，當(dāng)超聲功率為150 W時(shí)反應(yīng)速度最快，升高或降低超聲功率都會(huì)降低超聲作用的效果。很明顯不同強(qiáng)度的超聲對(duì)酶蛋白的影響效果是不同的，合適強(qiáng)度的超聲有可能改變甚至優(yōu)化酶分子的空間構(gòu)象，從而提高酶的催化活性；而高強(qiáng)度的超聲則有可能破壞酶的構(gòu)象，導(dǎo)致酶分子的變性失活。

Ultrasound power/W圖 3 超聲功率對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響*Figure 3 Effect of ultrasound power on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*間歇超聲50 s/30 s,其余同圖1

2.5 反應(yīng)溫度的影響

間歇超聲50 s/30 s,其余反應(yīng)條件同1.4,考察反應(yīng)溫度對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，在超聲作用下，酶分子對(duì)反應(yīng)溫度似乎變得更加敏感，溫度的微小波動(dòng)導(dǎo)致酶活大幅度改變，這與Gennaro[13]的研究結(jié)果一致。當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)，反應(yīng)速度最快。其原因可能是超聲的“空化作用”在較高溫度下更容易發(fā)生，當(dāng)超聲“空化作用”太劇烈的時(shí)候就會(huì)直接破壞酶分子的空間構(gòu)象，甚至直接破壞酶蛋白內(nèi)部某些化學(xué)鍵，從而容易引發(fā)酶蛋白的變性失活。

Temperature/℃圖 4 反應(yīng)溫度對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響*Figure 4 Effect of reaction temperature on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*間歇超聲50 s/30 s,其余同圖1

2.6 aw的影響

在含有微量水的有機(jī)介質(zhì)中，水分子可以直接或間接地通過(guò)氫鍵、疏水鍵及范德華力等非共價(jià)鍵相互作用來(lái)維持酶的催化活性所必需的構(gòu)象，因此在非水反應(yīng)介質(zhì)中水對(duì)酶催化反應(yīng)的影響是非常巨大的[14]。

aw圖 5 初始水活度(aw)對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響*Figure 5 Effect of initial water activity on synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by lipase*間歇超聲50 s/30 s,其余同圖1

間歇超聲50 s/30 s,其余反應(yīng)條件同1.4，考察aw對(duì)酶促合成己酸乙酯的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，aw對(duì)反應(yīng)速度的影響呈典型的“鐘”形曲線，當(dāng)aw為0.53時(shí)，反應(yīng)速度最快。

綜上所述，酶促合成己酸乙酯的最佳反應(yīng)條件為：正己烷20 mL(硅藻土40 mg, aw=0.53), 120 mmol·L-1己酸和乙醇，BSL2 100 mg,在超聲(150 W)清洗器中采用間歇超聲50 s/30 s，于50 ℃反應(yīng)20 min，反應(yīng)速度31.95 μmol·g-1·min-1(常規(guī)振蕩法的反應(yīng)速率8.18 μmol·g-1·min-1)。

3 結(jié)論

在超聲輔助酶促己酸乙酯合成反應(yīng)的研究中，考察了超聲發(fā)生裝置、超聲處理方法，超聲功率、超聲溫度以及初始水活度等反應(yīng)條件對(duì)酶活的影響。在最適反應(yīng)條件下，脂肪酶BSL2催化合成己酸乙酯的反應(yīng)速率相對(duì)常規(guī)振蕩提高了3.9倍。

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