國產(chǎn)膠原酶軟膏對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)及bFGF表達(dá)的影響

郭智輝 雷晉

深Ⅱ度度燙傷創(chuàng)面組織壞死達(dá)真皮，壞死組織的持續(xù)存在阻礙上皮爬行，也易造成細(xì)菌感染、炎性反應(yīng)加重，阻礙創(chuàng)面的修復(fù)。所以燙傷創(chuàng)面修復(fù)的首先要清除壞死組織。徹底的清創(chuàng)常損失臨近正常組織，不徹底的清創(chuàng)是術(shù)后感染的根源。膠原酶可以作用于變性的膠原蛋白，并且還可作用于壞死組織和正常組織間尚未發(fā)生變性的膠原蛋纖維，可以起到更徹底的清除壞死組織。近年來的研究[1]發(fā)現(xiàn)膠原酶除了有良好的脫痂作用外還可加速修復(fù)細(xì)胞對(duì)損傷的反應(yīng)和促進(jìn)傷口的愈合，但具體機(jī)制不清楚。本實(shí)驗(yàn)主要觀察膠原酶軟膏對(duì)在大鼠背部深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)的影響，測(cè)定愈合創(chuàng)面愈合過程中bFGF表達(dá)情況，以確定膠原酶軟膏促進(jìn)愈合是否與增加bFGF表達(dá)有關(guān)，并對(duì)其機(jī)制做初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠20只雄性體重200～230 g。

1.1.2 藥物 國產(chǎn)膠原酶軟膏由喬邦醫(yī)藥有限公司提供，bFGF試劑盒及購自博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要試驗(yàn)儀器 自行車備胎、恒溫水浴箱、秒表、顯微鏡、面積測(cè)量卡。

1.2 試驗(yàn)步驟

1.2.1 分組 每只大鼠背部造成兩個(gè)2 cm創(chuàng)面。隨機(jī)選擇一個(gè)作為實(shí)驗(yàn)組，另一個(gè)作為對(duì)照組。

1.2.2 動(dòng)物模型制作 燙傷前一天用8%硫化鈉在大鼠脊柱兩側(cè)脫毛。實(shí)驗(yàn)時(shí)將自行車備胎上對(duì)稱的剪兩個(gè)直徑2 cm的小孔。包住大鼠后雙孔離背部正中線1 cm，浸入90°水浴箱10 s后立即浸入冰水欲中造成深Ⅱ度燙傷，病理切片證實(shí)。

1.2.3 治療及標(biāo)本制作 每只大鼠隔日生理鹽水清洗創(chuàng)面后，實(shí)驗(yàn)組涂抹膠原酶軟膏1 mm厚，對(duì)照組貼上凡士林紗布。兩組均用無菌紗布包扎，膠布粘貼。于7、10、14、21 d取各取5只大鼠自創(chuàng)基及周圍少許組織后制作bFGF HE及免疫組化切片。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 創(chuàng)面愈合時(shí)間 創(chuàng)面完全上皮化時(shí)所用時(shí)間。

1.3.2 創(chuàng)面愈合率 于7、10、14、21 d用測(cè)量卡測(cè)量未愈合創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。

1.3.3 形態(tài)學(xué)觀察 每日觀察創(chuàng)面一般情況，鏡下觀察上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞遷移與增殖情況，肉芽組織生長及毛囊形成情況。

1.3.4 bFGF表達(dá)測(cè)定 免疫組化切片上bFGF陽性細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色、棕褐色。高倍鏡下每張切片觀察3個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，求平均值。

2 結(jié)果

2.1 愈合時(shí)間與愈合率 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合時(shí)間(20.75±1.71)d明顯短于對(duì)照組(25.25±1.71)d(t=6.971，P=0.006)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率明顯高于對(duì)照組(見表1)。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 7 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組痂皮邊緣開始軟化部分脫落，創(chuàng)緣有表皮爬行，成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，真皮內(nèi)可見殘存的毛囊上皮生長。對(duì)照組痂皮從創(chuàng)緣處剝脫;10 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組溶痂達(dá)高峰，成纖維細(xì)胞聚集，巨噬細(xì)胞數(shù)量較多，表皮從殘存的毛囊上皮向上生長迅速。對(duì)照組肉芽組織中成纖維細(xì)胞數(shù)量稀疏;14 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組壞死組織大部脫落，成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，殘存毛囊上皮向上生長形成皮島。對(duì)照組創(chuàng)面仍然存在較多壞死組織，上皮爬行速度慢，成纖維細(xì)胞數(shù)量較少;21 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組表皮基本全部覆蓋創(chuàng)面，新生上皮結(jié)構(gòu)成熟，皮下可見毛囊形成，成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)細(xì)小轉(zhuǎn)化為纖維細(xì)胞。對(duì)照組創(chuàng)面壞死組織基本清除干凈，尚未完全上皮化，愈合部分表皮內(nèi)和表皮下可見水泡，為瘢痕修復(fù)。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)組bFGF表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.05)，10 d明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。21 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見表3)。

表1 兩組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較(%，x ± s，n=20)

表2 兩組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)bFGF計(jì)數(shù)比較(個(gè)，x ± s，n=5)

3 討論

深Ⅱ度度燙傷創(chuàng)面痂皮緊密附著，阻礙上皮爬行和肉芽組織生長，成為細(xì)菌生長的良好培養(yǎng)基，導(dǎo)致炎性反應(yīng)加重或持續(xù)存在使創(chuàng)面愈合延遲。所以深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的修復(fù)首先要清除受損部位的痂皮。膠原酶特異性的分解自身變性的膠原蛋白以及介于壞死組織和正常組織之間尚未發(fā)生變性的膠原蛋白，解除物理占位、減輕炎性反應(yīng)，加速創(chuàng)面愈合。相關(guān)研究證實(shí)，在慢性創(chuàng)面愈合過程中內(nèi)源性膠原酶的活性和數(shù)量受到影響，補(bǔ)充外源性膠原酶很有必要。膠原酶軟膏應(yīng)用于深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面臨床報(bào)道較多[2-3]。本研究中實(shí)驗(yàn)組在創(chuàng)面愈合時(shí)間和愈合率兩個(gè)指標(biāo)方面明顯優(yōu)于對(duì)照組。表明應(yīng)用膠原酶軟膏脫痂可以促進(jìn)深Ⅱ度度燙傷創(chuàng)面的愈合。但對(duì)其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制有必要進(jìn)行深入研究。

bFGF是一種創(chuàng)傷修復(fù)中起主要作用的生長因子，作用于成纖維細(xì)胞增殖及肉芽組織形成和新生毛細(xì)血管化2個(gè)環(huán)節(jié)，既可作為絲裂原和趨化因子作用于成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，又是一種潛在的血管形成因子[4-5]。在深Ⅱ度度燙傷創(chuàng)面，痂皮的存在導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重或持續(xù)，抑制了bFGF的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組燙傷后7、10、14 d和bFGF表達(dá)均高于對(duì)照組(P＜0.05)。表明膠原酶在促進(jìn)脫痂過程中可以解除這種抑制，增加bFGF的表達(dá)。bFGF的表達(dá)增高的結(jié)果在病理切片上表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組上皮爬行與成纖維細(xì)胞增殖肉芽組織生長速度快于對(duì)照組。燙傷后21 d對(duì)照組壞死組織基本脫落，所以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 EGF、bFGF表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

另外本研究發(fā)現(xiàn)。燙傷后10 d實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組殘存的毛囊上皮都有生長，14 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組毛囊上皮生長旺盛，毛囊初步形成。而對(duì)照組毛囊上皮生長緩慢，毛囊發(fā)育停滯。這可能與對(duì)照組壞死組織的存在一方面增加IL-8等炎性介質(zhì)的釋放損害殘存的皮膚附件[7]，另一方面抑制bFGF的表達(dá)有關(guān)。有研究表明bFGF及其受體基因可能在皮膚的發(fā)生、結(jié)構(gòu)功能的維持以及損傷修復(fù)中起重要作用，是真皮乳頭細(xì)胞培養(yǎng)和毛囊誘導(dǎo)所必須的。這表明應(yīng)用膠原酶軟膏脫痂可以保護(hù)殘存的皮膚毛囊、促進(jìn)毛囊生長發(fā)育，顯著提高愈合質(zhì)量。

綜上，應(yīng)用膠原酶軟膏脫痂可以增加bFGF的表達(dá)。加速深Ⅱ度創(chuàng)面愈合，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。但對(duì)愈合后瘢痕形成情況及機(jī)制需進(jìn)一步臨床及實(shí)驗(yàn)研究

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