兒茶素對受照射大鼠急性肺損傷的保護作用及對TGF-β表達的影響

石衛(wèi)民 高 蕾 陳龍華 宋維舒 (廣東省第二人民醫(yī)院腫瘤一科，廣東 廣州 5037)

兒茶素對受照射大鼠急性肺損傷的保護作用及對TGF-β表達的影響

石衛(wèi)民 高 蕾1陳龍華2宋維舒 (廣東省第二人民醫(yī)院腫瘤一科，廣東 廣州 510317)

目的 闡明兒茶素對大鼠急性放射性肺損傷的保護作用及肺組織TGF-β表達水平的影響。方法 成年雌性Wistar大鼠40只，隨機分作4組：(1)空白對照組：10只，腹腔注射生理鹽水20 ml·kg－1·d－1。(2)單純兒茶素組：10只，腹腔注射兒茶素注射液100 mg· kg－1·d－1。(3)單純照射組：10只，全肺單次照射15 Gy+腹腔注射生理鹽水20 ml·kg－1·d－1。(4)照射+兒茶素組：10只，全肺單次照射15 Gy+兒茶素注射液100 mg·kg－1·d－1。于照射后2 w及6 w取各組大鼠5只，取肺組織作組織學與免疫組化分析。結果 照射組大鼠2 w和6 w時肺出現明顯炎性損傷，照射+兒茶素組的急性肺炎性改變較照射組明顯減輕;空白對照組和單純兒茶素組動物免疫組化TGF-β陽性細胞數相對較低，單純照射組的TGF-β陽性細胞數較上述兩組明顯增高(P＜0.05)，照射+兒茶素組的陽性細胞數介于兩者之間，也顯著低于單純照射組(P＜0.05)。結論 兒茶素對大鼠急性放射性肺損傷具有保護作用，而兒茶素能明顯降低該過程中TGF-β表達水平。提示兒茶素可能通過調控該細胞因子而起到輻射防護的作用。

兒茶素;肺;輻射損傷;TGF-β

射線輻射可以導致機體產生各種損傷，引起突變，誘發(fā)腫瘤及引起衰老。主要機制是放射線作用使機體產生大量自由基導致脂質過氧化。近年來有研究發(fā)現兒茶素是一種有效的羥自由基清除劑，能有效清除多種自由基，使射線的間接作用對機體損傷大為減少，從而起到輻射防護作用〔1〕。兒茶素主要有4種單體成分：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)和表兒茶素(EC)，有研究發(fā)現其單體及混合體對不同組織具有不同程度的輻射防護作用，其研究見于對于外周血淋巴細胞、小腸絨毛細胞等〔2～5〕。而目前尚未見對于放射性肺損傷的研究。轉化生長因子β(TGF-β)被認為是與放射性肺損傷發(fā)生發(fā)展關系最為密切的細胞因子。本實驗研究兒茶素混合體對大鼠急性放射性肺損傷以及肺組織TGF-β表達的影響和作用。

1 材料與方法

1.1 動物及兒茶素混合品

雌性Wistar大鼠，購自購自廣州省實驗動物中心，體重(200±20)g。供試前在SPF級清潔動物房常規(guī)飼養(yǎng)3 d，觀察無異常者進入實驗。兒茶素混合體(EGCG 50% ～60%，EGC 30%，余為ECG和EC)購自廣東省中藥研究所，純度95%以上。

1.2 照射條件

使用美國瓦里安公司的VARIAN 2300C直線加速器(廣州中醫(yī)藥大學廣東省中醫(yī)院放療科)產生的6 MV X線。照射時大鼠清醒狀態(tài)俯臥于體模固定板上，用瓦里安直線加速器6 MV X射線等距離照射全肺，照射野上界平大鼠腋窩，下界平胸骨劍突，左、右至胸廓外側，大鼠全身其余部分用擋鉛屏蔽。源皮距為 100 cm，計算點深度為 2 cm，劑量率為320 cGy/min，一次性照射劑量為15 Gy。

1.3 方法

①實驗大鼠隨機分為4組：對照組10只，兒茶素組10只，照射組10只，兒茶素加照射組10只。兒茶素加照射組動物每日予兒茶素溶于蒸餾水中，100 mg·kg－1·d－1予大鼠腹腔注射，從照射前1 d開始，直至照射后第6天，共腹腔注射7 d;單純兒茶素組以 100 mg·kg－1·d－1予大鼠腹腔注射7 d。實施照射后2 w、6 w，各組動物隨機取5只，處死后分別取肺組織在10%中性甲醛緩沖液中固定準備制作病理蠟塊。②HE染色光鏡觀察：由病理科醫(yī)生在顯微鏡下觀察肺組織病理學變化(盲法)。③肺組織TGF-β蛋白免疫組化染色檢測：一抗為Abcan生物技術公司兔抗鼠多克隆抗體，抗體工作濃度為8 μg/ml;二抗為福州邁新公司通用試劑盒，按試劑盒說明書操作。每張切片在400倍視野下選取10個有代表性、無重疊、不連續(xù)視野，盲法計數陽性細胞，取平均數。

1.4 統計學分析

各組動物TGF-β染色陽性的細胞數比較用t檢驗，用SPSS13.0軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 肉眼觀

大鼠肺照射2、6 w后，解剖肉眼可見單純照射組小鼠的肺組織表面明顯點片狀充血、出血病灶;而在照射+兒茶素組的肺組織僅呈充血狀，未見明顯出血病灶。

2.2 組織學結果

單照射組大鼠肺損傷較重，包括肺泡內出血及肺泡、支氣管上皮、血管的改變，血管周圍水腫均較明顯，特別是在單照射組大鼠由于肺泡出血引起肺實質灶性實變和肺泡上皮水腫。而兒茶素+照射組大鼠的肺泡間隔增厚、上皮細胞的損傷、血管的改變程度都較照射組減輕，見圖1。

2.3 免疫組化

①鏡下觀：空白對照組和單純兒茶素組，在其支氣管上皮中TGF-β呈不均一表達，在肺實質中少量肺泡巨噬細胞呈陽性表達，而血管內皮和肌層均呈陰性。單純照射組和照射+兒茶素組大鼠，2 w后即可見大量肺泡巨噬細胞和Ⅱ型肺泡細胞呈陽性表達，持續(xù)到照射后6 w。②陽性細胞計數：空白對照組和單純兒茶素組陽性細胞數相對較低，為(16±5)及(21±8)個。照射后2 w單純照射組的陽性細胞數為(168±21)個，較上述兩組明顯增高(P＜0.05);照射+兒茶素組的細胞數為(74±17)個，顯著低于單純照射組(P＜0.05)。照射后6 w單純照射組的陽性細胞數為(133±32)個仍高于照射+兒茶素組的細胞數〔(56±18)個，P＜0.05〕。見圖2。

圖1 各組大鼠肺組織病理學改變(HE，×100)

圖2 各組大鼠肺組織TGF-β表達(×200)

3 討論

兒茶素具有抗衰老、抑制炎癥反應、抑制腫瘤細胞增殖以及誘導腫瘤細胞凋亡等作用〔6～8〕。Matuo等〔9〕研究在 EGCG 處理和不處理的情況下用γ射線照射質粒DNA，測量pUC118 DNA雙鏈斷裂的數量，并且測定酵母細胞照射后突變的頻率，發(fā)現EGCG減少了γ射線導致的DNA損傷，也減少了照射引起的突變。Nair等〔5〕體外研究證實EC對質粒pBR322 DNA具有γ射線防護作用，在體實驗以EC處理大鼠1 h后全身照射γ射線4 Gy，用堿性彗星分析法測定其外周血淋巴細胞的DNA鏈斷裂情況，發(fā)現EC減輕了外周血淋巴細胞的DNA損傷。Lee等〔4〕研究經4種兒茶素單體或混合物處理后，大鼠經γ射線照射后的小腸絨毛存活、內生脾集落形成、小腸絨毛細胞凋亡情況，發(fā)現幾種兒茶素都對實驗動物具有輻射防護作用，4種單體混合物的放射防護作用強過任何一種單體。本研究采用兒茶素混合體，各個兒茶素單體對大鼠肺組織急性損傷的防護情況有待進一步研究。

放射性肺損傷，包括早期放射性肺炎和晚期放射性肺纖維化，是胸部腫瘤放療、骨髓移植預處理的常見并發(fā)癥，是一個有多種細胞參與、多種細胞因子調控的復雜過程，當肺臟受到照射后，分泌介導放射性肺損傷發(fā)生的細胞因子，包括TNF-α，IL-1α，IL-1β，IL-4，MCP-1 以及 TGF-β，PDGF，IGF-1，bFGF 等，介導了之后一系列損傷事件發(fā)生，產生病理組織學改變〔10〕。TGF-β被認為是與放射性肺纖維化發(fā)生關系最為密切的細胞因子，它不僅促進成纖維細胞的增殖及分化，而且可誘導肺泡巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞參與炎性反應。文獻報道，大鼠肺照射后早期即出現 TGF-β 的表達，血清中 TGF-β 升高〔11～13〕。本研究說明下調了肺組織TGF-β的表達，起到減輕肺組織急性炎性損傷的作用。

本研究證實兒茶素混合體對大鼠照射肺有一定保護作用，能夠減輕急性放射性肺損傷，可能是因為其能夠降低組織TGF-β的分泌。在肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中是否有其他細胞因子分泌的改變尚不清楚，各種兒茶素單體對大鼠肺組織的放射防護情況也有待進一步研究。

1 Jun X，Deji S，Ye L，et al.Comparison of in vitro antioxidant activities and bioactive components of green tea extracts by different extraction methods〔J〕.Int J Pharm，2011;408(1-2)：97-101.

2 Yamamoto T，Staples J，Wataha J，et al.Protective effects of EGCG on salivary gland cells treated with gamma-radiation or cis-platinum(Ⅱ)diam-mine dichloride〔J〕.Anticancer Res，2004;24(5A)：3065-73.

3 Katiyar SK，Mukhtar H.Green tea polyphenol(-)-epigallocatechin-3-gallate treatment to mouse skin prevents UVB-induced infiltration of leukocytes，depletion of antigen-presenting cells，and oxidative stress〔J〕.J Leukoc Biol，2001;69(5)：719-26.

4 Lee HJ，Kim JS，Moon C，et al.Modification of gamma-radiation response in mice by green tea polyphenols〔J〕.Phytother Res，2008;22(10)：1380-3.

5 Nair CK，Salvi VP.Protection of DNA from gamma-radiation induced strand breaks by Epicatechin〔J〕.Mutat Res，2008;650(1)：48-54.

6Relja B，T¨ottel E，Breig L，et al.Effects of green tea catechins on the proinflammatory response after haemorrhage/resuscitation in rats〔J〕.Br J Nutr，2011;4(1)：1-7.

7 Yang WH，Fong YC，Lee CY，et al.Epigallocatechin-3-gallate induces cell apoptosis of human chondrosarcoma cells through apoptosis signal-regulating kinase 1 pathway〔J〕.J Cell Biochem，2011;112(6)：1601-11.

8 Xu Y，Zhang JJ，Xiong L，et al.Green tea polyphenols inhibit cognitive impairment induced by chronic cerebral hypoperfusion via modulating oxidative stress〔J〕.J Nutr Biochem，2010;21(8)：741-8.

9 Matuo Y，Nishijima S，Ikeda T，et al.Radical scavenging effect of naturally-occurring epigallocatechin gallate against oxidative damage caused by gamma-ray radiation〔J〕.Radioisotopes，2008，57(12)：119-20.

10 張 海，王炳勝，劉秀芳，等.益氣活血中藥對大鼠TGF-β1、TNF-α的影響〔J〕.中華放射醫(yī)學與防護雜志，2009;29(4)：383-5.

11 方向明，胡春洪，胡曉云，等.兔放射性肺損傷模型的建立及鑒定〔J〕.中華放射醫(yī)學與防護雜志，2010;30(4)：417-22.

12 Lee KH，Rhee KH.Radioprotective effect of cyclo(L-Phenylalanyl-LProlyl)on irradiated rat lung〔J〕.J Microbiol Biotechnol，2008;18(2)：369-76.

13 吳稚冰，馬勝林，張愛琴，等.痰熱清注射液對大鼠急性放射性肺損傷的防治〔J〕.中華放射醫(yī)學與防護雜志，2008;28(4)：364-7.

R730.55

〕 A

1005-9202(2012)22-4945-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.042

2009年廣東省科技計劃項目(No.93053)

1 廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院大學城醫(yī)院

2 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院放療科

宋維舒(1962-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤放射治療學研究。

石衛(wèi)民(1971-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤放射治療學研究。

〔2012-04-09收稿 2012-05-18修回〕

(編輯 曲 莉)