復(fù)方石斛合劑調(diào)節(jié)胰島素受體表達(dá)促進(jìn)HepG2細(xì)胞糖代謝

張捷平 秦崇濤 林 凡 施 紅 (福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350108)

復(fù)方石斛合劑調(diào)節(jié)胰島素受體表達(dá)促進(jìn)HepG2細(xì)胞糖代謝

張捷平 秦崇濤 林 凡 施 紅 (福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350108)

目的 探討復(fù)方石斛合劑增加HepG2細(xì)胞胰島素信號促進(jìn)葡萄糖代謝的機制。方法 以高胰島素培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)胰島素抵抗(IR)狀態(tài)，繼以10%復(fù)方石斛合劑的含藥血清干預(yù)48 h，測定細(xì)胞6-磷酸果糖激酶、異檸檬酸脫氫酶的活性，RT-PCR與免疫印跡胰檢測島素受體mRNA與蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果 高濃度胰島素能降低6-磷酸果糖激酶、異檸檬酸脫氫酶的活性，降低胰島素受體的表達(dá);復(fù)方石斛合劑的治療能增加6-磷酸果糖激酶、異檸檬酸脫氫酶的活性(P＜0.05)，促進(jìn)胰島素受體的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平表達(dá)(P＜0.05)，逆轉(zhuǎn)高胰島素的下調(diào)影響。結(jié)論高濃度胰島素可誘發(fā)IR，復(fù)方石斛合劑能增加HepG2細(xì)胞胰島素受體的表達(dá)，提高葡萄糖分解代謝關(guān)鍵酶活性，緩解IR。

復(fù)方石斛合劑;胰島素抵抗;糖代謝;胰島素受體

胰島素抵抗(IR)是糖尿病、肥胖等代謝性疾病的共同的病理生理基礎(chǔ)〔1〕。高胰島素血癥，其既被認(rèn)為是IR發(fā)展的病理生理特征，同時也會加重IR的進(jìn)展〔2，3〕。本課題組前期系列研究表明，復(fù)方石斛合劑能明顯降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖、糖化血清蛋白，促進(jìn)胰島素分泌，改善 IR 狀態(tài)〔4，5〕;臨床實驗也表明，該方藥能降低2型糖尿病患者的血糖、糖化血清蛋白，糾正糖耐量異常，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗指數(shù)(ISI)〔6〕。本研究以HepG2細(xì)胞為對象，從細(xì)胞分子水平探討該方藥對高胰島素狀態(tài)誘發(fā)IR的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

復(fù)方石斛合劑(石斛、黃芪、丹參、五味子、葛根、生地黃、玄參、川牛膝)購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂。清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量250～300 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SYXK(滬)2007-0005。HepG2細(xì)胞，購自上海細(xì)胞所。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國);果糖-6-磷酸、醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸甘油脫氫酶、異檸檬酸、Actin一抗(Sigma，美國);瓊脂糖、NADH、NAD、ATP、ADP、DTT、PMSF(Amresco，美國)，SDS-PAGE 試劑盒、ECL(碧云天生物公司)，InsR-β 一抗(#3020，Cell Singaling，美國);Trizol、PCR引物(Invitrogen，美國);RT-PCR試劑盒、DNA分子量(Fermentas，美國);其他常用化學(xué)試劑(上海國藥試劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)方石斛合劑含藥血清的制備 復(fù)方石斛合劑以6倍水煎2次后過濾，兩次濾液合并后最終調(diào)至含生藥量1 g/ml。SD大鼠30只，隨機分為2組，即空白對照組和中藥組，每組15只。各組動物在同樣條件下飼養(yǎng)，早晚各1次灌胃給藥(空白對照組：等量的生理鹽水;中藥組：復(fù)方石斛合劑)用藥劑量依據(jù)2000年版《中華人民共和國藥典》根據(jù)人和動物體表面積折算的等效劑量比率表計算，連續(xù)7 d。于末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12 h)后2 h，乙醚麻醉，腹主動脈采血，低速離心分離血清，將每組動物的血清混合。經(jīng)56℃ 30 s滅活，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后，置－20℃冰箱備用。

1.2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù) HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培基，在37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)、傳代。待細(xì)胞生長至80%接觸，以無血清培養(yǎng)2 h，進(jìn)行如下處理：分為4組：對照組、高胰島素組、中藥組、高胰島素+中藥組。上述各組先以 10－9、10－7、10－9、10－7mol/L 的胰島素培養(yǎng) 24 h后，A、B組分別加入10%空白對照大鼠血清、給藥組分別加入10%含藥大鼠血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。檢測前，去掉舊培基，加入2 ml含10－9mol/L胰島素的無血清培養(yǎng)基于37℃溫育待測細(xì)胞15'后，檢測以下指標(biāo)。

1.2.3 葡萄糖代謝關(guān)鍵酶活性的測定 用PBS洗三次，加入100 μl提取液〔含50 mmol/L PBS(pH 7.2)，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT〕，刮下細(xì)胞，超聲破碎離心取上清液，用于酶活性測定。

1.2.3.1 6-磷酸果糖激酶-1(PFK)活性測定 根據(jù)Narabayashi等的方法〔7〕，在30℃反應(yīng)體系監(jiān)測340 nm處NADH的吸光度。PFK活性計算按：2 μmol/L NADH的減少相當(dāng)于1 μmol/L 1，6-二磷酸果糖的產(chǎn)生。

1.2.3.2 異檸檬酸脫氫酶(ICDH)活性測定 根據(jù)Rutter等〔8〕的方法，在30℃反應(yīng)體系監(jiān)測340 nm處NADH的吸光度。

1.2.4 半定量RT-PCR檢測細(xì)胞胰島素受體轉(zhuǎn)錄水平 用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，以O(shè)lig(dT)18為引物42℃逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，繼以引物1(上游5'-agtttgaggacatggagaatgtg-3'，下游5'-ataggaacgatctctgaactccac-3'，318 bp)與引物 2(上游 5'-tgtaaccaactgggacgatatg-3'，下游 5'-atctcttgctcgaagtctaggg-3'，456 bp) 分別擴增胰島素受體(InsR)與管家基因β-actin。反應(yīng)條件：變性94℃，30 s;退火 55℃(InsR)或 57℃(β-actin)30 s;延長 72℃，30 s;循環(huán)30次。擴增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

1.2.5 Western印跡檢測細(xì)胞蛋白水平的表達(dá) 培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌3次，加入全細(xì)胞裂解液，冰上裂解，超聲破碎，于4℃

離心15 s，上清為總蛋白提取液。取80 μg蛋白，以8%的SDSPAGE分離膠分離，全濕式電轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。3%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入稀釋的抗 InsR(1∶1 000)、抗 Actin(1∶2 000)的抗體，室溫雜交 1 h。用 PBST洗膜3次，每次5 s。續(xù)分別加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下溫育1 h，同樣洗膜3次，然后化學(xué)發(fā)光顯影。用BandScan圖像分析系統(tǒng)對上述PCR與Western印跡結(jié)果的區(qū)帶進(jìn)行光密度(IA)掃描，以β-Actin為內(nèi)對照，對InsR基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖代謝關(guān)鍵酶活性變化

高濃度胰島素(10－7mol/L)刺激HepG2細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)PFK與ICDH的活性較生理高胰島素(10－9mol/L)刺激的細(xì)胞的酶活性顯著降低(P＜0.05)。細(xì)胞在高胰島素刺激24 h之后，加入10%含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PFK與ICDH的活性比高濃度胰島素組明顯提高(P＜0.05)，比對照組稍低，但沒有顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 不同濃度胰島素及復(fù)方石斛合劑對PFK、ICDH活性影響( ± s，n=8，nmol·min－1·mg －1)

表1 不同濃度胰島素及復(fù)方石斛合劑對PFK、ICDH活性影響( ± s，n=8，nmol·min－1·mg －1)

與對照組比較：1)P＜0.05;與高胰島素組比較：2)P＜0.05，下表同

60.79±4.42 1.74±0.17高胰島素組 38.68±5.251) 1.45±0.251)中藥組 65.68±4.73 1.85±0.27高胰島素+中藥組 55.07±5.012) 1.64±0.202)PFK ICDH對照組組別

2.2 胰島素受體表達(dá)變化

高濃度胰島素(10－7mol/L)刺激HepG2細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)InsR mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯下降(P＜0.05)較生理高胰島素(10－9mol/L)刺激的對照組顯著降低(P＜0.05)。高濃度胰島素刺激24 h，再加入10%含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h，InsR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)比高濃度胰島素組有明顯提高(P＜0.05)。比對照組稍低，但沒有顯著性差異(P＞0.05)。見圖1、2及表2。

圖1 胰島素及復(fù)方石斛合劑對InsR mRNA表達(dá)影響

表2 不同濃度胰島素及復(fù)方石斛合劑對InsR mRNA與蛋白表達(dá)的比率分析(± s，n=5)

表2 不同濃度胰島素及復(fù)方石斛合劑對InsR mRNA與蛋白表達(dá)的比率分析(± s，n=5)

0.79±0.12 0.96±0.15高胰島素組 0.33±0.191) 0.42±0.171)中藥組 0.85±0.13 0.98±0.20高胰島素+中藥組 0.72±0.172) 0.93±0.212)蛋白質(zhì)對照組組別 mRNA

圖2 胰島素及復(fù)方石斛合劑對InsR蛋白表達(dá)影響

3 討論

胰島素是胰島β細(xì)胞合成與分泌的一種蛋白質(zhì)激素，通過與靶細(xì)胞膜上InsR的細(xì)胞外α亞基結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)β亞基酪氨酸殘基磷酸化，即激活受體本身的酪氨酸激酶活性，使之成為激活態(tài)，進(jìn)一步活化細(xì)胞內(nèi)特定信號蛋白，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)代謝、蛋白質(zhì)合成等生理效應(yīng)。肝細(xì)胞中葡萄糖氧化分解的關(guān)鍵酶(如PFK、ICDH等)是胰島素作用的靶酶之一，胰島素可以通過直接或間接的化學(xué)修飾作用，使其磷酸化，快速增加酶活性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖利用。

研究表明參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子(如InsR、IRSs、PI3K、Akt、PTP1B)等的數(shù)量、結(jié)構(gòu)及分布的異常，將導(dǎo)致胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，誘發(fā) IR狀態(tài)〔9，10〕。在 IR的早期，機體胰島素敏感性下降，胰島β細(xì)胞能代償性地增加分泌胰島素，彌補效應(yīng)不足;但是持續(xù)的高胰島素血癥會下調(diào)胰島素敏感組織細(xì)胞的胰島素信號分子表達(dá)，從而進(jìn)一步加重胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的障礙〔11〕。本實驗以10－7mol/L胰島素培養(yǎng) HepG2細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)InsR表達(dá)顯著下降，制備得到IR的細(xì)胞模型。InsR作為細(xì)胞膜上胰島素信號轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白，其數(shù)量減少將直接導(dǎo)致胰島素信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱，并最終產(chǎn)生對生理劑量(10－9mol/L)胰島素刺激的抵抗?fàn)顟B(tài)，導(dǎo)致糖代謝關(guān)鍵酶PFK、ICDH活性下降，葡萄糖氧化分解減少。

復(fù)方石斛合劑由石斛、黃芪、丹參、五味子、葛根、生地黃、玄參、川牛膝組成。本實驗說明該方藥具有促進(jìn)肝細(xì)胞氧化分解葡萄糖的功效;同時在高濃度胰島素培養(yǎng)24 h，再加入該含藥血清培養(yǎng)48 h，能一定程度逆轉(zhuǎn)InsR表達(dá)的減少，增加對生理水平胰島素的敏感性，恢復(fù)PFK、ICDH活性，從而緩解高胰島素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞IR狀態(tài)，對維持細(xì)胞正常的葡萄糖分解利用有重要意義。

由于參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號分子較多，不同中藥的作用不盡相同，已發(fā)現(xiàn)部分具備降糖作用的復(fù)方中藥與單味中藥直接作用于胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，增加胰島素的敏感性，緩解IR。如復(fù)方黃邊降糖片及小檗堿增加不同組織細(xì)胞的InsR、IRS-1/2的蛋白表達(dá)，或促進(jìn)蛋白酪氨酸殘基磷酸化水平或抑制絲氨酸磷酸化〔12，13〕;麥花葉黃酮通過抑制PTP1B活性，改善IR〔14〕。因此復(fù)方石斛合劑是否也存在著對其他胰島素信號分子表達(dá)或修飾的調(diào)節(jié)，值得進(jìn)一步研究。此外，代謝酶的活性調(diào)節(jié)，主要包括快速調(diào)節(jié)與遲緩調(diào)節(jié)兩種方式。該方藥是否還存在直接上調(diào)代謝酶蛋白PFK、ICDH的表達(dá)從而增加酶活性，也是研究的方向。

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Dendrobium compound improving glucose metabolism in HepG2 cell by regulating insulin receptor expression

ZHANG Jie-Ping，QIN Cong-Tao，LIN Fan，et al.
College of Integrated TCM-WM，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，F(xiàn)ujian，China

Objective To investigate Dendrobium Compound(DC)improving HepG2 cells glucose metabolism and the mechanism of insulin signal transduction.Methods Incubated HepG2 cells with high concentration insulin for 24 h to develop insulin resistance(IR)，followed by 10%compound mixture containing serum of DC 48 h，the activity of phosphofructo-1-kinase，isocitrate dehydrogenase and the mRNA and protein of insulin receptor were measured.Results High concentrations of insulin could reduce the activity of phosphofructo-1-kinase，isocitrate dehydrogenase，reduce expression insulin receptor.the expression on levels of transcription and translation.And DC treatment could increase the activity of phosphofructo-1-kinase，isocitrate dehydrogenase(P＜0.05)，improve insulin receptor transcription and translation levels(P＜0.05)，reverse the downregulation effect of high insulin.Conclusions High concentrations of insulin could induce IR in HepG2 cells.DC could improve glucose metabolism and insulin signal transduction by enhancing the activity of key enzymes involved in glucose metabolism and the expression of insulin receptor，and alleviate IR.

Dendrobium compound;Insulin resistance;Glucose metabolism;Insulin receptor

R589.2

A

〕 1005-9202(2012)22-4930-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.036

福建省教育廳課題(No.JB08159)

施 紅(1964-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病臨床與基礎(chǔ)研究。

張捷平(1976-)，男，講師，碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

〔2011-08-22收稿 2011-12-11修回〕

(編輯 曹夢園)