胰島素對(duì)初診2型糖尿病患者Th1/Th2平衡的影響

吳曉燕 湯旭磊 傅松波 楊 芳 高 林 (蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000)

2型糖尿病(T2DM)患者存在Th1/Th2細(xì)胞失衡〔1〕，研究發(fā)現(xiàn)胰島素(Ins)治療可能調(diào)節(jié)Th淋巴細(xì)胞的功能〔2〕。本研究擬通過測(cè)定Ins治療前后T2DM患者及正常人外周血中的Th1、Th2細(xì)胞及其 Th1/Th2比值，探討 T淋巴細(xì)胞亞群與T2DM發(fā)病的關(guān)系以及Ins對(duì)新發(fā)T2DM患者的Th1/Th2平衡的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 正常對(duì)照組：20例，男12例，女8例，健康體檢者，年齡(50.5±6.0)歲，漢族，無糖尿病及其他自身免疫性疾病。糖尿病組：新診斷的T2DM患者30例，男16例，女14例，系本院內(nèi)分泌科住院患者，年齡(52.9±9.7)歲，44～78歲。入組患者均無糖尿病急慢性并發(fā)癥，也無自身免疫性疾病，感染，腫瘤等。

1.2 試劑與儀器 PERCP標(biāo)記的抗CD4單抗，PE標(biāo)記的抗IL-4單抗，PITC標(biāo)記的抗IFN-γ單抗，均為鼠抗人。FITC和PE，PERCP標(biāo)記的鼠IgG1同型對(duì)照免疫球蛋白，佛波醇乙酯(PMA)，離子霉素(Ionomycin)，布雷菲德菌素 A(BFA)和Fix＆Perm破膜劑均購自美國 Caltag公司。高敏 C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)試劑盒晶美生物工程有限公司。胰島素(Ins)試劑盒天津九鼎生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀為美國Coulter公司EPICS-XL型。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)符合條件的30例患者，入組時(shí)及治療12 w后查HbA1c、Th1、Th2空腹及 OGTT2h血糖、空腹及 OGTT 2 h胰島素，血清hs-CRP，并記錄體重變化。試驗(yàn)期間，盡量使空腹血糖小于7.0 mmol/L、餐后2h血糖小于10 mmol/L為滿意，根據(jù)血糖調(diào)整Ins用量。

1.3.2 Th1/Th2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 肝素抗凝血5 ml，淋巴細(xì)胞分離液分離單核細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106/ml，將細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入刺激劑PMA(20 ng/ml)，離子霉素(1 μg/ml)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BFA(2 μg/ml)以阻止細(xì)胞因子向細(xì)胞外分泌。37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)5 h，對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行染色，加入破膜劑進(jìn)行固定-破膜打孔以利于細(xì)胞因子單抗進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，每管加入10 μl INF-γ單抗和IL-4單抗，以相應(yīng)的同種型對(duì)照IgG單抗作對(duì)照染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)分泌INF-γ的CD4+細(xì)胞Th1和分泌IL-4的CD4+細(xì)胞Th2進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 血清hs-CRP的測(cè)定 取晨起空腹靜脈血2 ml，用ELISA測(cè)定。單位為ng/ml。正常參考值為254～16 104 ng/ml。

1.3.4 血糖、胰島素及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 空腹10 h取晨血5 ml測(cè)定空腹血糖(FBG，葡萄糖氧化酶法)、空腹血清胰島素(FINS、放射免疫法)、Homa B胰島素分泌指數(shù)=20×空腹胰島素/(空腹血糖－3.5)是評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞分泌功能的一個(gè)指標(biāo)，胰島素敏感性指數(shù)(ISI)=ln〔1/空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mU/L)〕是評(píng)價(jià)胰島素抵抗的一個(gè)指標(biāo)。糖化血紅蛋白(HbA1c)，免疫分析法，德國Bayer公司DC2000型HbA1c檢測(cè)儀及檢測(cè)試劑盒。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS8.0統(tǒng)計(jì)軟件包。正態(tài)資料以s表示，偏態(tài)資料經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后按正態(tài)資料數(shù)據(jù)處理，組間比較用單因素方差分析，再以SNK行組間兩兩比較。相關(guān)分析用直線相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料比較 T2DM患者Ins治療前的Th1百分比，Th1/Th2比值較正常對(duì)照組明顯下降(P＜0.05)，Th2與正常對(duì)照組無明顯差異，血清hs-CRP濃度顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，Homa B較正常組顯著下降(P＜0.01)。T2DM患者Ins治療后與治療前相比Th1細(xì)胞百分比顯著性升高(P＜0.05)，Th2細(xì)胞百分比下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，治療前后Th1/Th2比值相比差異有顯著性(P＜0.05)。Homa B較治療前顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。C反應(yīng)蛋白較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療后Th1、Th2細(xì)胞百分比、Th1/Th2比值與對(duì)照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

表1 2型糖尿病患者治療前后與正常人臨床及實(shí)驗(yàn)室資料比較(s)

表1 2型糖尿病患者治療前后與正常人臨床及實(shí)驗(yàn)室資料比較(s)

與正常對(duì)照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與治療前比較：3)P ＜0.05，4)P ＜0.01

Homa B ISI T2DM治療前 24.02±0.70 10.93±0.702) 1.99±0.281) 2.82±0.35 0.76±0.062) 9.70±1.011) 33 281±1 1682) 25.8±7.92)組別 BMI(kg/m2)FBG(mmol/L)Th1(%)Th2(%)Th1/Th2 HbA1c(%)hs-CRP(ng/ml)－2.73±0.27 T2DM治療后 24.62±0.43 6.54±0.824)2.89±0.313)2.23±0.27 1.35±0.083)6.21±0.833)16 564±1 0453)69.8±11.44)－2.56±0.22正常對(duì)照組 23.32±0.57 5.00±0.26 3.28±0.21 2.45±0.22 1.45±0.12 5.00±0.74 10 073±1 177 86.3±17.1 －2.22±0.14

2.2 T2DM患者外周血Th1/Th2淋巴細(xì)胞及血清hs-CRP水平與ISI相關(guān)性 T2DM患者外周血Th1淋巴細(xì)胞值與HbA1c具有明顯的相關(guān)性(r=－0.68，P＜0.01)，患者Th2及Th1/Th2與HbA1c之間無相關(guān)性(P＞0.05)。Th2淋巴細(xì)胞值與Homa B具有明顯的相關(guān)性(r=－0.54，P＜0.01)。T2DM患者血清hs-CRP水平與ISI呈顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.38，P＜0.01)。

3 討論

研究認(rèn)為T2DM可能是炎癥因子介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，炎癥因子導(dǎo)致了胰島B細(xì)胞分泌胰島素功能受損及產(chǎn)生胰島素抵抗〔3，4〕。CD4+T輔助細(xì)胞(Th)是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的一種主要細(xì)胞，Th1細(xì)胞主要負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫應(yīng)答、遲發(fā)性超敏反應(yīng)(炎癥反應(yīng))、Th2細(xì)胞與體液免疫有關(guān)。生理?xiàng)l件下，機(jī)體的Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞處于相對(duì)平衡狀態(tài)，在疾病狀態(tài)下，這種平衡被打破，Th1，Th2細(xì)胞所致不同優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答與疾病的發(fā)生，發(fā)展，預(yù)后有關(guān)。近來Th1/Th2細(xì)胞與糖尿病的關(guān)系日益受到關(guān)注，Katz等〔5〕認(rèn)為Th1細(xì)胞有可能促進(jìn)1型糖尿病的發(fā)生，而Th2細(xì)胞對(duì)1型糖尿病有保護(hù)作用，Th1/Th2細(xì)胞的失衡在1型糖尿病的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)與1型糖尿病不同，新診斷的T2DM患者Th1細(xì)胞百分比降低，而Th2細(xì)胞百分比升高，Th1/Th2比值明顯下降，提示T2DM是一種Th2占優(yōu)勢(shì)的疾病。本研究還發(fā)現(xiàn)，T2DM患者Th1值與糖化血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)，Th2淋巴細(xì)胞值與Homa B具有明顯的負(fù)相關(guān)，提示Th1細(xì)胞劣勢(shì)所致的細(xì)胞免疫缺陷可能引起了高血糖的發(fā)生，Th2淋巴細(xì)胞的升高導(dǎo)致了胰島β細(xì)胞分泌功能的下降。雖然Th2與正常人比無差異，但Th1細(xì)胞亞群的改變導(dǎo)致了Th2亞群的變化，Th2型細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞活化，而產(chǎn)生過量IgG，也可促進(jìn)殺傷性T淋巴細(xì)胞克隆的過度激活，該作用與其他細(xì)胞因子和效應(yīng)分子產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用結(jié)合，可以引起胰島β細(xì)胞死亡〔6〕，Th2細(xì)胞因子可能也通過體液免疫途徑參與了T2DM患者的發(fā)病。

近來研究顯示，在T2DM的早期給予胰島素短期強(qiáng)化治療，可以帶來長期改善血糖控制的作用，可以使患者及時(shí)回到T2DM自然病程的早期階段〔7〕。Ins是一種廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的激素，體外研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的Ins可抑制Th2類細(xì)胞因子分泌而增加Th1類細(xì)胞因子分泌，能通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞分泌Th1/Th2細(xì)胞因子的作用而影響免疫系統(tǒng)功能〔8〕研究發(fā)現(xiàn)Ins除了使1型糖尿病胰島β細(xì)胞得到充分休息外，還可能調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞Th2亞群，恢復(fù)Th1/Th2之間的平衡，胰島素可促進(jìn)Th2功能，抑制Th1細(xì)胞殺傷能力，減少對(duì)胰島β細(xì)胞的免疫殺傷〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素能誘導(dǎo)NOD小鼠抗原特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞產(chǎn)生，通過分泌IL-4，IL-10，TGF-β在胰島內(nèi)抑制Th1型細(xì)胞及其他效應(yīng)細(xì)胞，使IFN-γ表達(dá)顯著下調(diào)，從而保護(hù)胰島免受破壞，分泌胰島素維持正常血糖〔10〕。

本研究發(fā)現(xiàn)胰島素治療后T2DMTh1升高，Th2降低，從而使Th亞群平衡向Th1方向漂移。減輕了炎癥反應(yīng)，改善了胰島β細(xì)胞的分泌功能。本文發(fā)現(xiàn)，T2DM患者外周血中Th1、Th2水平與上述1型糖尿病患者結(jié)果呈現(xiàn)相反的情形，Th1細(xì)胞表現(xiàn)下降趨勢(shì)，Th2細(xì)胞表現(xiàn)上升趨勢(shì)。提示不同類型的糖尿病，Th細(xì)胞亞群表現(xiàn)不同的細(xì)胞優(yōu)勢(shì)，這一結(jié)論尚需后續(xù)的大量研究進(jìn)一步探討。故目前尚不能簡(jiǎn)單認(rèn)為對(duì)于糖尿病患者來說，Th1細(xì)胞一定有益，而Th2細(xì)胞一定有害，而應(yīng)從Th1/Th2失衡方面去進(jìn)行更為深入的研究。

1 吳曉燕，湯旭磊，高 林.2型糖尿病免疫炎癥的初步探討〔J〕.中國免疫學(xué)雜志，2007;23(10)：944-6.

2 The EURODIAB Substudy 2 Study Group1.Decreased prevalence of atopic diseases in children with diabetes〔J〕.J Pediatr，2000;137：470-4.

3 邱明才.糖尿病的多器官免疫損傷〔J〕.國際內(nèi)分泌代謝雜志，2006;26(3)：215-6.

4 Fsta A，Agostno RD，Howeard G，et al.Chronic subclinical inflammation as part of the insulin resistance syndrome〔J〕.Circulation，2001;102(1)：42-7.

5 Katz JD，Benoist C，Mathis D.T helper cell subsets in insulin-dependent diabetes〔J〕.Science，1995;268(5214)：1185-8.

6 John A，Colwell MD.Inflammation and diabetic vascular complications〔J〕.Diabetes Care，1999;22(12)：1927-8.

7 祝 方，紀(jì)立農(nóng)，韓學(xué)堯，等.短期胰島素強(qiáng)化治療誘導(dǎo)初診2型糖尿病患者血糖長期良好控制的臨床試驗(yàn)〔J〕.中國糖尿病雜志，2003;11(1)：5-9.

8 Glasdone P，Nepom GT.The prevention of IDDM.Injecting insulin into the cytokine network〔J〕.Diabetes，1995;44：859-62.

9 高 云，何權(quán)瀛，馬艷良.胰島素對(duì)體外培養(yǎng)人淋巴細(xì)胞生成Thl/Th2因子平衡的調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國糖尿病雜志，2007;15(2)：107-8.

10 Leng Q，Bentwich Z.Beyond self and nonself：fuzzy recognition of the immune system〔J〕.Scand J Immunol，2002;56(2)：224-32.