肥厚型心肌病左心室心肌纖維化及骨橋蛋白表達變化

湯大為，林國生，黃京璐，劉 超，郝 博，余彥耿，孔小平，權(quán) 力，廖信彪，羅 斌

（1.中山大學中山醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 510080；2.佛山市公安局南海區(qū)分局，廣東 佛山 528000；3.廣州市公安局刑事科學技術(shù)研究所，廣東 廣州 510030；4.廣東省公安廳刑事技術(shù)中心，廣東 廣州 510050；5.廣州市公安局番禺區(qū)分局，廣東 廣州 511400）

肥厚型心肌病左心室心肌纖維化及骨橋蛋白表達變化

湯大為1，林國生2，黃京璐1，劉 超3，郝 博1，余彥耿4，孔小平5，權(quán) 力1，廖信彪4，羅 斌1

（1.中山大學中山醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 510080；2.佛山市公安局南海區(qū)分局，廣東 佛山 528000；3.廣州市公安局刑事科學技術(shù)研究所，廣東 廣州 510030；4.廣東省公安廳刑事技術(shù)中心，廣東 廣州 510050；5.廣州市公安局番禺區(qū)分局，廣東 廣州 511400）

目的 研究肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）死者心肌間質(zhì)纖維組織含量及心肌細胞中骨橋蛋白的表達，探討骨橋蛋白在鑒定HCM致死案件中的法醫(yī)學意義。 方法 選取15例HCM致死者左心室心肌為HCM組、15例冠心病心肌肥厚致死者左心室心肌為冠心病組及20例交通事故及高墜致死者左心室心肌為對照組，應(yīng)用HE染色、Masson三色染色法和免疫組化法比較3組左心室心肌間質(zhì)中膠原容積分數(shù)及心肌細胞內(nèi)骨橋蛋白陽性表達的變化，并利用圖像分析軟件進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果 HCM組和冠心病組左心室心肌間質(zhì)膠原容積分數(shù)高于對照組（P＜0.05），而HCM組與冠心病組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；HCM組和冠心病組左心室心肌細胞骨橋蛋白陽性表達積分光密度值均高于對照組（P＜0.05），且HCM組高于冠心病組 （P＜0.05）。 結(jié)論 心肌間質(zhì)膠原纖維含量的增高和骨橋蛋白過度表達可能在HCM心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用，可作為HCM致心源性猝死的輔助診斷指標。

法醫(yī)病理學；心肌病，肥厚性；纖維化；骨橋蛋白質(zhì)

肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是指無導(dǎo)致心肌異常負荷因素（如高血壓、瓣膜病）而發(fā)生的心室壁增厚或質(zhì)量增加的一種疾病。據(jù)估計，HCM在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為0.2%[1]。HCM人群年死亡率約為1%[2]，是年輕人心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）的首位病因[3]。HCM的臨床表現(xiàn)一般為呼吸困難、胸痛、心悸、暈厥及SCD。其中，SCD是HCM最嚴重的表現(xiàn)型，往往也是HCM致死者的首次癥狀表現(xiàn)[4-5]。

目前對HCM致死者的法醫(yī)病理學診斷缺乏特異性的指標。近年來研究表明，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）可通過促進膠原沉積加速心肌重構(gòu)的進程，在心血管重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[6]。本研究利用Masson三色染色法和免疫組化法觀察左心室心肌組織中心肌纖維化及OPN的表達情況，探討OPN在HCM致死案例鑒定中的法醫(yī)學意義。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組

收集2007年1月—2011年8月中山大學法醫(yī)鑒定中心檢案左心室心肌組織蠟塊，選取心臟質(zhì)量400g以上、HCM致死案件15例，作為HCM組；心臟質(zhì)量400g以上、冠心病心肌肥厚致死案件15例，作為冠心病組；交通事故及高墜致死案件20例，作為對照組。

1.2 主要儀器及試劑

ExcelsiorTMES自動組織脫水機、Histocentre 3TM組織包埋機［美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司］，SM2000R石蠟切片機（德國Leica公司），DP70型熒光顯微鏡、DP-BSW軟件（日本奧林巴斯公司），電熱水浴箱（北京醫(yī)療器械廠），電熱恒溫箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），艾柯實驗室超純水系統(tǒng)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司），Image-Pro Plus 6.0彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

兔抗人OPN（分泌性磷酸化蛋白質(zhì)-1）多克隆抗體、PBS粉劑、檸檬酸抗原修復(fù)液（武漢博士德生物工程有限公司），生物素標記的鼠兔通用快捷型抗體（福建邁新生物科技技術(shù)開發(fā)有限公司），Masson三色試劑盒（廣州儷科貿(mào)易有限公司）。

1.3 固定、取材及切片

所有尸體低溫保存1～3d內(nèi)進行解剖檢驗，常規(guī)取材心臟經(jīng)10%甲醛固定72 h后，于左心室前壁冠狀溝下1cm處取左心室心肌組織，進行脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片3張，厚度為4 μm，分別進行HE常規(guī)染色、Masson三色染色和OPN免疫組化法染色。

1.4 HE染色

將3組切片分別進行HE常規(guī)染色，光學顯微鏡下觀察。

1.5 Masson三色染色

將3組切片在Bouin或Zenker液固定一晚，流水沖洗至無色，天青石藍染色5min，Mayer’s蘇木素染色5min，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗數(shù)分鐘，麗春紅酸性品紅液染5～10min，蒸餾水稍沖洗，1%磷鉬酸水溶液處理5min，直接用苯胺藍或亮綠染色5min，1%冰醋酸處理5 min，95%乙醇脫水多次，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。光學顯微鏡下觀察。

1.6 OPN免疫組化染色

將3組切片脫蠟，水化；3%甲醇過氧化氫溶液（80%甲醇）去除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫靜置15min；PBS洗片3次，每次5 min；高壓熱修復(fù)法（EDTA溶液，pH=8.0）修復(fù)抗原10min；PBS洗片3次，每次5min，滴加正常山羊非免疫血清，室溫保濕孵育20 min；滴加兔抗人OPN（分泌性磷酸化蛋白質(zhì)-1）多克隆抗體（1∶100稀釋），空白對照組以PBS代替一抗，4℃保濕孵育過夜；37℃復(fù)溫30min，PBS清洗3次；滴加生物素標記的鼠兔通用快捷型抗體，室溫保濕孵育45min；PBS洗片3次，每次5 min，顯微鏡下觀察DAB顯色（約1min）；蘇木素復(fù)染1min，1%鹽酸-乙醇分化，自來水中返藍30min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察。

1.7 心肌間質(zhì)膠原容積分數(shù)計算

Masson三色染色以藍色膠原沉積為陽性信號，光鏡下心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色。每張切片隨機選取5個不重復(fù)的視野（×200倍）進行拍照。用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析，計算心肌間質(zhì)膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）。CVF=膠原面積/全視野面積，取均值。

1.8 心肌細胞OPN陽性表達判定及積分光密度計算

心肌細胞中OPN陽性表達呈深棕黃色顆粒狀。每張切片隨機選取5個不重復(fù)視野（×400倍）進行拍照。用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析。計算心肌細胞內(nèi)OPN陽性表達的積分光密度（integral optical density，IOD），取均值。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，以上兩組計量資料均以±s表示，分別進行單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果

對照組：心肌橫紋尚清，部分心肌纖維斷裂或呈波浪狀排列，未見壞死及炎癥細胞浸潤；間質(zhì)血管擴張、充血（圖1A）。冠心病組：心肌橫紋欠清，部分心肌纖維斷裂或呈波浪狀排列，間質(zhì)內(nèi)見多個陳舊性梗死小灶，伴有少量炎癥細胞浸潤（圖1B）。HCM組：心肌細胞肥大，細胞核形態(tài)巨大、畸形（圖1C），間質(zhì)中增生的纖維結(jié)締組織將心肌分隔成束狀及旋渦狀排列（圖1D）；心肌血管壁增厚，管腔縮小，周圍見毛細血管增生。

圖1 3組心肌組織HE染色結(jié)果

2.2 Masson三色染色結(jié)果

對照組：心肌細胞呈紅色，細胞橫切面積未見異常，間質(zhì)內(nèi)見少量藍色膠原纖維（圖2A）。冠心病組：心肌細胞呈紅色，部分細胞橫切面積增大，間質(zhì)內(nèi)見藍色膠原纖維灶性形成（圖2B）。HCM組：心肌細胞呈紅色，多數(shù)細胞橫切面積肥大，間質(zhì)內(nèi)見大片藍色膠原纖維組織增生，并圍繞個別心肌呈旋渦狀排列（圖2C）。

應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對Masson三色染色的圖片進行分析，結(jié)果顯示HCM組心肌間質(zhì)中CVF（0.226±0.028）和冠心病組心肌間質(zhì)中CVF（0.252± 0.071）較對照組心肌間質(zhì)中CVF（0.085±0.017）均有增高（P＜0.05），而HCM組和冠心病組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 OPN免疫組化染色結(jié)果

對照組：少量心肌細胞內(nèi)OPN陽性表達（圖3A）；冠心病組：心肌細胞內(nèi)OPN陽性表達增多（圖3B）；HCM組：心肌細胞內(nèi)OPN陽性表達顯著增多（圖3C）。

圖2 3組心肌組織Masson三色染色結(jié)果 ×200

圖3 3組心肌組織OPN免疫組化染色結(jié)果 ×400

應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件對OPN免疫組化染色圖片進行分析，結(jié)果顯示HCM組、冠心病組及對照組的心肌細胞中OPN陽性顆粒達均有不同程度表達，HCM組OPN陽性表達IOD（259103±26850）和冠心病組OPN陽性表達IOD（125 066±32 521）均較對照組（56 301±28 023）增高（P＜0.05），且HCM組也高于冠心病組（P＜0.05）。

3 討 論

HCM被認為是一種常染色體顯性遺傳性疾病，發(fā)病機制尚不明確[7]。HCM可呈家族性發(fā)病，也可散發(fā)性發(fā)病。在法醫(yī)實際檢案中，由于HCM致死者通常無任何臨床癥狀下突然死亡，死者家屬往往無法接受，對死因爭議較大。然而法醫(yī)工作者在對其進行死因鑒定時，往往缺乏相關(guān)臨床資料，只有通過尸體解剖，先排除暴力或其他疾病致死的可能，把心臟外觀增大、心室肌肥厚以及心肌組織學改變作為診斷HCM的主要鑒定依據(jù)[8]。

3.1 HCM心肌纖維化的法醫(yī)學意義

心肌纖維化是指在心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量積聚、膠原濃度顯著升高或CVF顯著增加[9]。從總體上講，心肌纖維化是膠原合成代謝和降解代謝失衡的結(jié)果，形成機制非常復(fù)雜。本實驗采用Masson三色染色法首先對HCM組、冠心病組及對照組左心室心肌膠原纖維進行特殊染色，結(jié)果顯示，HCM組和冠心病組中CVF較對照組均有明顯增高，而HCM組與冠心病組兩組之間的CVF差異無統(tǒng)計學意義。同時也發(fā)現(xiàn)，HCM組與冠心病組的肥厚心肌組織經(jīng)特殊染色后心肌纖維化程度差異無統(tǒng)計學意義，這可能是由于HCM和冠心病心肌肥厚均可導(dǎo)致心肌間質(zhì)膠原纖維含量的增生，所以心肌纖維化被認為是HCM和冠心病發(fā)展到某一階段共同的病理形態(tài)學改變。心肌纖維化是一個復(fù)雜的病理過程，需要腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及多種細胞因子的參與，心臟疾病可導(dǎo)致心肌纖維化，進而發(fā)展為心肌肥厚、心肌硬度增加、心室舒張功能障礙，最終可引發(fā)心力衰竭甚至SCD。因此，本實驗結(jié)果提示，心肌纖維化這一形態(tài)學改變可作為HCM與正常心肌組織的輔助鑒別指標，但對于HCM與心肌肥厚的冠心病心肌組織，不能根據(jù)心肌纖維化程度對其二者進行鑒別。

3.2 HCM中OPN陽性表達的法醫(yī)學意義

OPN最初由 Oldberg等[10]在小鼠骨組織發(fā)現(xiàn)。OPN屬于分泌型糖基化磷蛋白，在巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及上皮細胞等多種細胞中有表達，參與多種生理病理過程。一方面，Trueblood等[11]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)心肌內(nèi)OPN含量與心?、裥湍z原mRNA表達存在相關(guān)性。在擴張型心肌病患者心肌中OPN、Ⅰ型和Ⅱ型膠原mRNA也明顯升高，OPN mRNA與Ⅰ型膠原及CVF存在明確的相關(guān)性，且與左室收縮末期內(nèi)徑及射血分數(shù)有關(guān)，即表明OPN與膠原存在正相關(guān)性[12]。另一方面，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中重要效應(yīng)分子血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）促進OPN的過度表達，加速心肌纖維化[13]。同時，OPN也可作為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族的底物[14]，在MMP調(diào)節(jié)膠原沉積及細胞外基質(zhì)降解程中可能起著重要作用[15]。這些研究均表明OPN在心臟纖維化及心臟重塑中起著非常關(guān)鍵的作用。本研究選擇OPN作為標志物，觀察OPN在3組左心室心肌細胞中的表達變化，結(jié)果顯示，OPN在3組心肌細胞中均有表達，HCM組和冠心病組左心室心肌組織OPN陽性表達明顯高于對照組，說明當發(fā)生心肌纖維化時，心肌細胞中OPN被異常激活和表達，參與心肌肥厚的病理發(fā)展過程，提示該指標在心肌肥厚的診斷中存在一定的法醫(yī)學價值。同時發(fā)現(xiàn)，HCM組OPN陽性表達也明顯高于冠心病組，差異具有統(tǒng)計學意義。因此，我們猜測OPN在表達量上的差異性，可能是由于HCM與冠心病發(fā)病機制不同，所致心肌纖維化的病理途徑也不同。有文獻報道，冠心病也可被認為是一種慢性炎癥性“疾病”[16]，當發(fā)生心肌梗死時，壞死的心肌組織可激活多種炎癥因子誘導(dǎo)炎性修復(fù)，形成陳舊性梗死灶，這種發(fā)生心肌壞死的纖維化增生，又被稱為“修復(fù)性纖維化”[17]。據(jù)組織學研究顯示，HCM患者心肌細胞肥大，心肌間質(zhì)纖維化[2]，增生的纖維組織包繞肥大的心肌細胞，排列紊亂（通常涉及心室的20%[18]），這種間質(zhì)纖維化被稱為“反應(yīng)性纖維化”[17]。從這一角度來看，也提示不同心臟疾病甚至同種心臟疾病中也可能存在不同類型心肌纖維化。因此，OPN的陽性表達對于診斷HCM致SCD具有較好的特異性，為鑒定HCM死因提供微觀病理學依據(jù)，同時也有可能應(yīng)用于鑒別HCM與冠心病致心肌肥厚。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，法醫(yī)工作者對HCM致SCD的鑒定也可通過基因篩查尋找診斷依據(jù)。對懷疑HCM死者進行基因測序，不僅有助于法醫(yī)工作者明確死因、消除紛爭，還有可能發(fā)現(xiàn)家族型HCM家族中的新病例和無癥狀攜帶者，為HCM人群預(yù)防SCD給予指導(dǎo)。

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2012-03-22）

（本文編輯：張建華）

Changes of Left Ventricular Myocardial Collagen Fibers and Osteopontin Expression in Hypertrophic Cardiomyopathy

TANG Da-wei1,LIN Guo-sheng2,HUANG Jing-lu1,LIU Chao3,HAO Bo1,YU Yan-geng4,KONG Xiaoping5,QUAN Li1,LIAO Xin-biao4,LUO Bin1
（1.Department of Forensic Medicine,Zhongshan Medical College,SunYat-sen University,Guangzhou 510080, China;2.Nanhai Branch of Foshan Public Security Bureau,Foshan 528000,China;3.Institute of Criminal Science and Technology,Guangzhou Public Security Bureau,Guangzhou 510030,China;4.Center of Criminal Science and Technology,Guangdong Public Security Bureau,Guangzhou 510050,China;5.Panyu Branch of Guangzhou Public Security Bureau,Guangzhou 511400,China）

Objective To investigate the changes of collagen fibers and the expression of osteopontin in the left ventricle in cases of hypertrophic cardiomyopathy（HCM）,along with the significance of their potential forensic application.Methods Fifteen cases of HCM,15 cases of coronary heart disease with cardiac hypertrophy and 20 cases of traffic accidents were selected as HCM group,coronary heart disease group and control group,respectively.Collagen volume fraction and osteopontin expression were observed and compared by HE staining,Masson trichrome staining and immunohistochemistry methods.Imaging and statistical methods were used for quantitative analysis.Results Collagen volume fraction in left ventricle of HCM and coronary heart disease were significantly higher than that in the control group（Plt;0.05）,which was not significantly different between the HCM group and the coronary heart disease group.The integral light density value of osteopontin in left ventricular cardiomyocytes of the HCM group and the coronary heart disease group were significantly higher than that of the control group（Plt;0.05）,and the value of the HCM group was also significantly higher than that of coronary heart disease group（Plt;0.05）.Conclusion The increased contents of collagen fibers and the overexpression of osteopontin may play an important role in myocardial fibrosis,and they can be used as markers in aid of diagnosing sudden death due to HCM.

forensic pathology;cardiomyopathy,hypertrophic;fibrosis;osteopontin

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.04.002

1004-5619（2012）04-0247-05

國家自然科學基金資助項目（39700167）；公安部科技基礎(chǔ)專項資助項目（2011GABJc009）；廣東省科技計劃項目（2010B031000006）

湯大為（1986—），女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學研究；E-mail：41493256@qq.com

羅斌，男，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學（猝死疾病）研究；E-mail：luobin@mail.sysu.edu.cn