明日葉中總黃酮的微波輔助提取工藝和檢測方法研究

鄒毓蘭，單 虎，高桂余，呂海濤，*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109）

明日葉中總黃酮的微波輔助提取工藝和檢測方法研究

鄒毓蘭1，單 虎2，高桂余1，呂海濤1，*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109）

對明日葉中總黃酮的提取工藝和檢測方法進(jìn)行了研究。采用微波法，利用單因素和正交實(shí)驗對明日葉中總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，分別通過AlCl3和Al（NO3）3顯色法，建立了明日葉中總黃酮的分光光度檢測方法。結(jié)果表明，AlCl3顯色法的最佳提取條件為：乙醇濃度85%、提取3次、料液比1∶25（g/mL）、微波功率600W、提取80s，樣品中總黃酮的得率為1.48%；Al（NO3）3顯色法的最佳提取條件為：乙醇濃度40%、提取3次、料液比1∶25（g/mL）、微波功率700W、提取80s，樣品中總黃酮的得率為1.67%。另外，對兩種顯色方法的顯色穩(wěn)定性進(jìn)行了初步探討。

明日葉，總黃酮，正交實(shí)驗，微波輔助提取

明日葉原產(chǎn)地在日本著名健康長壽之鄉(xiāng)八丈島，屬于傘科多年生草本耐寒植物[1]。明日葉被譽(yù)為“21世紀(jì)的健康食品”，富含特有成分查爾酮和香豆素及人體需要的多種成分。具有抗?jié)?、抗血栓、抗癌、降血壓、降膽固醇的作用，并能夠預(yù)防肝硬化、動脈硬化，改善胃腸道功能、改善睡眠、改善視力、提高人體免疫力[2-6]。黃酮類化合物又叫做生物總黃酮，具有增強(qiáng)心血管功能、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗菌消炎、抗輻射、延緩衰老以及治療慢性前列腺炎等作用[7-10]，是包括明日葉在內(nèi)的許多中草藥的有效成分。目前，國內(nèi)對明日葉的開發(fā)尚處于初級階段，對明日葉中總黃酮的提取工藝及檢測方法的研究尚未見報道[11-13]，具有極大的開發(fā)潛力。與常規(guī)提取方法相比，微波提取具有選擇性高、快速高效、溶劑消耗少、活性成分提取率較高、不產(chǎn)生噪音、適合于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的提取等優(yōu)點(diǎn)。本文利用微波法對明日葉中黃酮的提取進(jìn)行了研究，并對其測定方法進(jìn)行了探討，為開發(fā)和利用明日葉中的黃酮類成分提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明日葉樣品 購于本地藥店，已干燥至恒重；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 購于Sigma公司；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氯化鋁等試劑 均為分析純。

紫外-可見光分光光度計 日本島津；CASCADA超純水系統(tǒng) Pall Corporation；AR2140電子天平 上海奧豪斯國際工貿(mào)公司；50～200μL P200移液器、200～1000μL P1000移液器 北京吉爾森科技有限公司；循環(huán)水真空泵SHB-B88 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；微波合成萃取儀 北京祥鵠科技有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 明日葉總黃酮含量的測定

1.2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品5.0mg，用60%乙醇定容于50mL的容量瓶中，即得0.10mg/mL蘆丁對照品溶液。

1.2.1.2 AlCl3顯色法 精密量取對照品溶液1.0mL，置于10mL容量瓶中，加入4.0mL 80%乙醇，搖勻，再加入4mL 1%AlCl3溶液，用80%乙醇定容，搖勻，放置10min，在300～600nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到最大吸收波長為409nm。

精密量取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分別加入80%乙醇補(bǔ)至5mL，按照上述操作，在409nm下測其吸光度。以蘆丁對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸線方程為：y=0.0271x-0.0393，相關(guān)系數(shù)為0.9981。1.2.1.3 Al（NO3）3顯色法 精密量取對照品溶液4.0mL，置于25mL容量瓶中，加入80%乙醇6.0mL、5%NaNO2和10%Al（NO3）3溶液各1mL，靜置5min，加入4%NaOH溶液5mL，搖勻，放置5min，用80%乙醇定容，在400～700nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到最大吸收波長為500nm。

精密量取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，置于25mL容量瓶中，分別加入80%乙醇補(bǔ)至6.0mL，按照上述操作，在500nm下測其吸光度。以蘆丁對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：y=0.0085x+0.0085，相關(guān)系數(shù)為0.9953。

1.2.1.4 樣品液的制備和總黃酮含量的測定 準(zhǔn)確稱量明日葉1g，置于250mL三口瓶中，加入一定量、一定濃度的乙醇溶液，在微波合成萃取儀中提取，控制微波功率和提取時間，提取結(jié)束后將三口瓶取出冷卻至室溫，抽濾；多次提取時，將濾渣轉(zhuǎn)移到三口瓶中重復(fù)操作，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，用80%乙醇定容至100mL。分別用AlCl3顯色法和Al（NO3）3顯色法，按照上述操作測定其吸光度，由回歸方程計算出總黃酮的含量，進(jìn)而求出樣品中總黃酮的得率。

1.2.2 單因素實(shí)驗

1.2.2.1 提取時間的影響 稱取1g明日葉，置于250mL三口瓶中，加入30mL 80%乙醇，微波功率設(shè)為700W，溫度為80℃，提取時間分別為30、60、90、120、150s，分別利用AlCl3顯色法和Al（NO3）3顯色法測定出樣品中總黃酮的得率。

1.2.2.2 微波功率對提取效率的影響 稱取1g明日葉，置于250mL三口瓶中，加入30mL 80%乙醇，提取90s，溫度為80℃，微波功率分別設(shè)為500、600、700、800、900、1000W，分別利用AlCl3顯色法和Al（NO3）3顯色法測定出樣品中總黃酮的得率。

1.2.2.3 料液比對提取效率的影響 稱取1g明日葉，置于250mL三口瓶中，微波功率設(shè)為600W，溫度為80℃，乙醇濃度80%，提取90s，加入乙醇的量分別為10、15、20、25、30mL，分別利用AlCl3顯色法和Al（NO3）3顯色法測定出樣品中總黃酮的得率。

1.2.2.4 溫度對提取效率的影響 稱取1g明日葉，置于250mL三口瓶中，加入25mL 80%乙醇，微波功率設(shè)為600W，提取90s，溫度分別為40、50、60、70、80℃，分別利用AlCl3顯色法和Al（NO3）3顯色法測定出樣品中總黃酮的得率。

1.2.2.5 乙醇濃度對提取效率的影響 稱取1g明日葉，置于250mL三口瓶中，微波功率設(shè)為600W，提取90s，溫度為80℃，溶劑分別為蒸餾水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和無水乙醇，分別利用AlCl3顯色法和Al（NO3）3顯色法測定出樣品中總黃酮的得率。1.2.3 正交實(shí)驗 在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（A）、提取時間（B）、提取功率（C）、料液比（D）和提取次數(shù)（E）為考察因素，以樣品中總黃酮的得率為考察指標(biāo)，設(shè)計五因素四水平的正交實(shí)驗（表1）。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of total flavonoids

1.2.4 顯色穩(wěn)定性實(shí)驗 將制得的供試品溶液平均分成三份，一份在室溫下、一份放置在冰箱中低溫避光下保存、一份放置在陽光照射下，每隔一段時間，分別利用AlCl3顯色法和Al（NO3）3顯色法測供試品溶液的吸光度，以此來考察供試品溶液的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗結(jié)果

圖1 提取時間對樣品總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on total flavonoids yield

2.1.1 提取時間對樣品中總黃酮得率的影響 從圖1可以看出，兩種方法樣品中總黃酮的得率都具有相同的變化趨勢，總黃酮的得率隨著提取時間的延長先增加后減小，當(dāng)提取時間為90s時，總黃酮的得率達(dá)到最高；當(dāng)提取時間大于90s時，總黃酮得率下降。這可能是因為在提取初期，黃酮在微波的作用下能較快地從基體中分離，能夠快速溶出；但隨著提取時間的增加，體系的溫度會過熱并出現(xiàn)爆沸的現(xiàn)象，一方面高溫可能導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)分解；另一方面，爆沸也會引起部分藥材被沖至容器壁上，影響液固兩相的進(jìn)一步接觸，使得率降低[14-15]。

2.1.2 微波功率對樣品中總黃酮得率的影響 從圖2可以看出，兩種方法樣品中總黃酮的得率都具有相同的變化趨勢，AlCl3顯色法在500～700W時，功率對樣品中總黃酮得率影響不大，兩種顯色方法總黃酮得率在600W時達(dá)到最大，功率大于700W之后，總黃酮得率趨于下降。

圖2 微波提取功率對樣品總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on total flavonoids yield

2.1.3 料液比對樣品中總黃酮得率的影響 從圖3可以看出，兩種方法樣品中總黃酮的得率都具有相同的變化趨勢，隨著提取溶劑的增多，樣品中總黃酮得率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶25時總黃酮得率達(dá)到最大。

圖3 料液比對樣品總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of material and liquid ratio on total flavonoids yield

2.1.4 溫度對樣品中總黃酮得率的影響 從圖4可以看出，兩種方法樣品中總黃酮的得率都具有相同的變化趨勢，總黃酮得率均隨著溫度的升高而逐漸增加。

圖4 提取溫度對樣品中總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of temperature on total flavonoids yield

2.1.5 乙醇濃度對樣品中總黃酮得率的影響 從圖5可以看出，兩種方法樣品中總黃酮的得率都具有相同的變化趨勢，總黃酮得率均隨著乙醇濃度增大而增大，在濃度為80%時的總黃酮得率最大，之后開始下降。

圖5 乙醇濃度對樣品中總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield

2.2 正交實(shí)驗結(jié)果

表2 正交實(shí)驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

由表2正交實(shí)驗直觀分析可知，AlCl3顯色法中各因素對總黃酮得率的影響順序為：A＞E＞D＞C＞B。由表3方差分析可知，從統(tǒng)計學(xué)的角度而言，五個因素均為不顯著性因素，得出最佳提取條件為A4B2C2D3E3，即：乙醇濃度85%，提取3次，料液比1∶25（g/mL），提取功率600W，提取80s。

由表2正交實(shí)驗直觀分析可知，Al（NO3）3顯色法中各因素對總黃酮得率的影響順序為：A＞E＞B＞C＞D。由表3方差分析表可知，從統(tǒng)計學(xué)的角度而言，五個因素均為不顯著性因素，得出最佳提取條件是A1B2C3D3E3，即：乙醇濃度40%，提取3次，料液比1∶25（g/mL），提取功率700W，提取80s。

表3 AlCl3顯色法總黃酮得率方差分析表Table 3 Intiutive analysis result of total flavonoids yield

2.2.1 最佳工藝條件的驗證 在最佳提取工藝條件下提取，用相同方法檢測，重復(fù)5次，AlCl3顯色法檢測的樣品中總黃酮的平均得率是1.48%，RSD%=0.67，Al（NO3）3顯色法檢測的樣品中總黃酮的平均得率是1.67%，RSD%=2.59，均與正交表的最高得率基本一致。表明利用兩種顯色方法測定，提取的總黃酮含量高，工藝穩(wěn)定。

相比較而言，Al（NO3）3顯色法測得的總黃酮的含量比AlCl3顯色法測得的含量要相對高一些，文獻(xiàn)中關(guān)于總黃酮的檢測方法大多用Al（NO3）3顯色法，因為在中性或者堿性的條件下，黃酮類化合物會與鋁鹽形成螯合物，Al（NO3）3顯色法對于某些非黃酮類化合物在500nm處也有吸收，致使測得的含量比AlCl3顯色法要高，提取工藝更穩(wěn)定。

2.2.2 加標(biāo)回收率實(shí)驗 最佳提取工藝條件下的樣品，加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，分別用AlCl3和Al（NO3）3顯色法檢測出加標(biāo)后樣品中總黃酮含量，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，兩種顯色方法的加標(biāo)回收率均比較高而且比較穩(wěn)定，從而說明總黃酮的兩種顯色法檢測結(jié)果均準(zhǔn)確、可靠。

表4 加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 4 Rusult of standard addition recovery

2.3 顯色穩(wěn)定性實(shí)驗

圖6 低溫下穩(wěn)定性實(shí)驗Fig.6 Results of the stability in the refrigerator with 4℃

圖7 室溫下穩(wěn)定性實(shí)驗Fig.7 Results of the stability in room temperature

圖8 陽光照射下穩(wěn)定性實(shí)驗Fig.8 Results of the stability under sunlight

如圖6～圖8所示，在低溫（4℃）、室溫和陽光照射下兩種顯色法供試品溶液吸光度隨時間的延長雖有所變化，但總體變化不大，說明兩種顯色法是比較穩(wěn)定的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗探究了明日葉中總黃酮的微波提取工藝，AlCl3顯色法的最佳提取工藝為：乙醇濃度85%，提取3次，料液比1∶25（g/mL），提取功率600W，提取80s，樣品中總黃酮得率為1.48%；Al（NO3）3顯色法的最佳提取工藝為：乙醇濃度40%，提取3次，料液比1∶25（g/mL），提取功率700W，提取時間80s，樣品中總黃酮得率為1.67%，工藝合理、簡單、穩(wěn)定性好。

同時，探究了AlCl3和Al（NO3）3兩種顯色方式的分光光度法檢測明日葉中的總黃酮，兩種顯色檢測方法簡單、可靠，Al（NO3）3顯色法測得的總黃酮得率要稍高于AlCl3顯色法。顯色溶液在室溫下、陽光照射下、低溫避光下具有良好的穩(wěn)定性。

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Study on microwave-assisted extraction and determination of total flavonoids from Angelica Keiskei Koidzumi

ZOU Yu-lan1，SHAN Hu2，GAO Gui-yu1，LV Hai-tao1，*
（1.College of Chemistry and Pharmaceutical Sciences，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Department of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

The extraction and determination techniques of total flavonoids in Angelica Keiskei Koidzumi were investigated.The microwave-assisted extraction progress of total flavonoids was studied to get the optimum conditions by single factor and orthogonal experiments.The content of total flavonoids was determined by ultraviolet-visible spectrophotometer with AlCl3and Al（NO3）3developing methods，respectively.The optimum conditions of AlCl3developing method were 85%ethanol concentration，extraction 3 times，600W microwave power，1∶25 of material to liquid ratio，80 seconds extraction time.Under these conditions，the total flavonoids yield was 1.48%.The optimum conditions of Al（NO3）3developing method were 40%ethanol concentration，extraction 3 times，700W microwave power，1∶25 of material to liquid ratio，80 seconds extraction time.Under these conditions，the total flavonoids yield was 1.67%.The preliminary study for the stability of chromogenic solution was also investigated.

Angelica Keiskei Koidzumi；total flavonoids；orthogonal test；microwave-assisted extraction

TS201.1

B

1002-0306（2012）05-0201-05

2011－06－14 *通訊聯(lián)系人

鄒毓蘭（1986-），女，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)及其應(yīng)用研究。

國家十二五科技支撐課題（2011BAD34B03）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)重點(diǎn)項目（610608）。