南瓜籽仁蛋白多肽的酶法制備和抗氧化活性研究

張淑蓉，武 瑜，梁葉星，鐘 耕，2，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400716；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶400715）

南瓜籽仁蛋白多肽的酶法制備和抗氧化活性研究

張淑蓉1，武 瑜1，梁葉星1，鐘 耕1，2，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400716；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶400715）

以酸溶性氮得率為評價(jià)指標(biāo)，用木瓜蛋白酶制備南瓜籽仁蛋白多肽。通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解條件，確定其最佳酶解工藝為：底物濃度1%、加酶量4%、酶解溫度60℃、酶解時(shí)間4h，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得南瓜籽多肽酶解液的酸溶性氮得率為43.52%±0.39%，其多肽的抗氧化活性可達(dá)到VC的20%以上。

南瓜籽粕，酶解，多肽，抗氧化

南瓜籽仁含有多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、多糖類等營養(yǎng)成分，以及南瓜籽堿、腺嘌呤、葫蘆巴堿等生物堿[1]。研究證實(shí)，南瓜籽油中含有一種男性荷爾蒙活性生物觸媒劑成分，能消除前列腺的初期腫脹，對泌尿系統(tǒng)及前列腺增生有良好的治療及預(yù)防作用[2-3]。南瓜籽仁的蛋白質(zhì)含量高達(dá)30%～40%，脫脂南瓜籽仁粕的蛋白含量可達(dá)50%以上，所含必需氨基酸比例與人體所需氨基酸組成模式相似，可提供維持人類生長所需要的氨基酸和能量，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源[4]。研究表明，南瓜籽蛋白不僅具有降血糖和抗氧化作用[5]，而且對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和誘導(dǎo)分化作用[6]。近年來我國對南瓜籽的加工利用主要集中在其油脂上，對南瓜籽蛋白方面的研究與發(fā)達(dá)國家相比較少。目前大多數(shù)南瓜籽仁粕一般只被當(dāng)作工業(yè)廢料處理，或用做普通飼料的添加物，造成優(yōu)質(zhì)蛋白資源的浪費(fèi)。生物活性肽在人體生長發(fā)育、新陳代謝過程中起著關(guān)鍵作用，已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。大豆多肽、玉米多肽、蕎麥多肽、小麥多肽和花生多肽等多種植物多肽的制備工藝已有相關(guān)報(bào)道[7]，但對南瓜籽仁粕蛋白多肽的研究相對較少。本文用酶法將南瓜籽仁粕中的蛋白降解，并進(jìn)一步將其多肽的抗氧化活性與VC的抗氧化活性進(jìn)行研究比較，不僅可以解決南瓜籽仁餅粕蛋白的綜合利用問題，也可以為南瓜籽餅粕蛋白的產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜籽 產(chǎn)自云南省文山州硯山縣（無殼南瓜籽中粗蛋白含量可達(dá)34.70%±0.38%，粗脂肪含量44.11% ±1.03%，水分含量7.50%±0.06%）；木瓜蛋白酶 酶活力50萬U/g，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。

LG-06A型粉碎機(jī) 瑞安市百信藥機(jī)器械廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；TGL-16G型臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Kjelflex K-360型半自動凱氏定氮儀 瑞士Buchi；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Spectrum Lab 22pc型可見分光光度計(jì) Leuqquang公司等；PHS－3C型pH計(jì) 上海盛磁儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫脂南瓜籽仁粕粉的制備 將南瓜籽去皮得仁，粉碎后過80目篩，得南瓜籽仁粉。稱取20g南瓜籽仁粉于濾紙筒中，索氏抽提4h，回收石油醚，濾紙筒內(nèi)殘留物即為南瓜籽仁粕，經(jīng)真空加熱（55℃）脫溶，過100目篩，獲得脫脂南瓜籽仁粕粉，密封置于陰涼處備用。經(jīng)測定，南瓜籽仁粕中蛋白質(zhì)含量可達(dá)53.94%±0.40%，相當(dāng)于去殼南瓜籽仁中蛋白質(zhì)含量為34.70%±0.38%。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定 參照GB/T 5009.5－2003。

1.2.3 酸溶性氮得率的測定[8]脫脂南瓜籽仁粕粉在一定條件下酶解，過濾取上清液，調(diào)節(jié)上清液pH至4.5，使水溶性蛋白等電沉淀，離心（5000r/min）10min，取上清液，用凱氏定氮法測得上清液中可溶性氮則視為酸溶性氮，經(jīng)下式計(jì)算可得酸溶性氮得率：

1.2.4 南瓜籽仁蛋白多肽的制備工藝流程 南瓜籽仁粕粉→調(diào)底物濃度→調(diào)溫→調(diào)pH→酶解→滅酶→過濾→沉淀蛋白→離心→活性炭脫苦、脫色→濃縮[9]

準(zhǔn)確稱取南瓜籽仁粕粉，加適量純水配制成一定質(zhì)量濃度的南瓜籽仁粕懸濁液，調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋中溫度至反應(yīng)溫度，調(diào)pH至7.0[10]，加入一定比例的木瓜蛋白酶，攪拌，恒溫酶解，并不斷攪拌，同時(shí)滴加0.1mol/L的NaOH以保持體系pH恒定。達(dá)到反應(yīng)預(yù)定時(shí)間后，將南瓜籽仁粕蛋白酶解液迅速放入100℃水浴中，保溫5min使酶活力喪失，抽濾得濾液，用0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液pH至4.5，使水溶性蛋白等電沉淀，離心后取上清液，用活性炭（1∶10）進(jìn)行脫苦、脫色處理后[11]，離心去活性炭，取上清液在旋轉(zhuǎn)真空泵中濃縮得產(chǎn)物。

1.2.5 酶解單因素實(shí)驗(yàn)及優(yōu)化酶解條件的正交實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 底物濃度對酸溶性氮得率的影響 配制底物蛋白濃度為0.5%、1%、2%、3%的懸濁液，并依次加入5%木瓜蛋白酶（以蛋白濃度計(jì)算），使酶均勻分散于水中后加入到南瓜籽仁粕粉懸濁液中，置于55℃恒溫水浴鍋中水解2h，過濾后取上清液。用0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，使水溶性蛋白等電沉淀，離心后取上清液，測酸溶性氮得率。

1.2.5.2 加酶量對酸溶性氮得率的影響 取相當(dāng)于蛋白濃度1%的南瓜籽仁粕懸濁液，分別加入3%、4%、5%、6%的木瓜蛋白酶，于55℃恒溫水浴鍋中水解2h，過濾得濾液，等電點(diǎn)沉淀蛋白后離心，測上清液中酸溶性氮得率。

1.2.5.3 溫度對酸溶性氮得率的影響 取相當(dāng)于蛋白濃度1%的南瓜籽仁粕粉懸濁液，加酶量4%，分別置于50、55、60、65℃恒溫水浴鍋中水解2h，過濾得濾液，等電沉淀蛋白后離心，測上清液中酸溶性氮得率。

1.2.5.4 時(shí)間對酸溶性氮得率的影響 取相當(dāng)于蛋白濃度1%的南瓜籽仁粕粉懸濁液，加酶量4%，置于55℃水浴鍋中分別水解2、3、4、5、6h，過濾得濾液，等電點(diǎn)沉淀蛋白后離心，測上清液中酸溶性氮得率。

1.2.5.5 南瓜籽粕酶解的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了優(yōu)化南瓜籽仁粕酶解的反應(yīng)條件，在單因素實(shí)驗(yàn)初步確定的酶解條件的基礎(chǔ)上，以酸溶性氮得率為評判指標(biāo)，選擇底物濃度、加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間為因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 優(yōu)化酶解L9（34）正交因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment on enzymatic hydrolysis

1.2.6 優(yōu)化條件下所得水解液中固形物含量的測定

水解后濾液經(jīng)蛋白等電點(diǎn)沉淀，離心所得上清液中可溶性氮可視為肽氮[12]，所含固形物可視為南瓜籽仁多肽和氨基酸。

準(zhǔn)確稱取10g南瓜籽仁粕粉，依正交實(shí)驗(yàn)所得的優(yōu)化工藝進(jìn)行水解，水解液于5000r/min離心10min，取上清液，50℃下用活性炭攪拌處理30min后，同樣條件下離心去活性炭，上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，轉(zhuǎn)入容量瓶中，定容至100mL[13]。

稱取25g先后用6mol/L濃鹽酸和蒸餾水沖洗、干燥后的石英砂于平底皿中，連同皿蓋、玻璃棒置于105℃烘箱中干燥至恒重，稱重m0。加入10mL肽液于平底皿中，連同皿蓋、玻璃棒稱重m1。用玻璃棒將肽液與石英砂混勻，連同皿蓋、玻璃棒一起放入105℃烘箱中烘至恒重后，稱重m2[14]。

1.2.7 南瓜籽仁蛋白多肽抗氧化性質(zhì)的研究 以正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所獲得的最優(yōu)工藝參數(shù)，制備南瓜籽仁粕蛋白酶解液。參照He Yenhun等[15]的方法，取1mL濃度各為0.1、0.5、1、5、20mg/mL的樣品液，分別加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液和2.5mL的磷酸鹽緩沖液（pH6.6，0.2mol/L），混勻后在50℃水浴20min，然后加入2.5mL10%的三氯乙酸，混勻后以3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1%的FeCl3，混勻后在700nm波長下比色，以去離子水作為空白，記錄吸光度值。以VC作為對照，吸光度值越大則樣品的抗氧化能力越強(qiáng)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物濃度對酸溶性氮得率的影響

底物濃度對酸溶性氮得率的影響結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在底物濃度較低時(shí)，酸溶性氮得率隨底物濃度的增加而提高；當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^1%后，酸溶性氮得率趨于平衡而略有下降。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，酸溶性氮得率顯著高于底物濃度為0.5%、3%時(shí)的酸溶性氮得率（P＜0.05）；與底物濃度為2%時(shí)差異不顯著（P＞0.05）。因此，初步將反應(yīng)底物濃度定為1%。

2.2 加酶量對酸溶性氮得率的影響

加酶量對酸溶性氮得率的影響結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在其它因素固定不變的條件下，南瓜籽仁粕蛋白酶解液中的酸溶性氮得率隨著酶用量的增大而升高。酶用量在4%以下時(shí)，酸溶性氮含量增長顯著（P＜0.05），酶用量為4%以上時(shí)，酸溶性氮得率含量增長緩慢（P＞0.05）。據(jù)翟瑞文等[16]的報(bào)道，酶量過高時(shí)，由于酶本身的相互水解作用加強(qiáng)，會阻礙酶對底物的水解。另外從生產(chǎn)成本考慮，加酶量初步定于4%。

圖1 底物濃度對酸溶性氮得率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on yield of acid soluble nitrogen

圖2 加酶量對酸溶性氮得率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on yield of acid soluble nitrogen

2.3 溫度對酸溶性氮得率的影響

溫度對酸溶性氮得率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對酸溶性氮得率的影響Fig.3 Effect of temperature on yield of acid soluble nitrogen

如圖3所示，溫度從45℃上升到55℃，南瓜籽蛋白酶解液中酸溶性氮得率呈顯著上升趨勢（P＜0.05），但當(dāng)溫度從55℃上升到60℃時(shí)，酸溶性氮得率增長不顯著（P＞0.05）；繼續(xù)升溫，酸溶性氮得率顯著下降（P＜0.05）。因此，初步確定水解溫度為55℃。

2.4 時(shí)間對酸溶性氮得率的影響

時(shí)間對酸溶性氮得率的影響結(jié)果見圖4。

如圖4所示，在其它因素固定不變的條件下，南瓜籽仁粕粉酶解液中的酸溶性氮得率隨著酶解時(shí)間的增加而升高。水解時(shí)間小于4h時(shí)，酸溶性氮得率增長趨勢較明顯（P＜0.05），當(dāng)水解時(shí)間大于4h時(shí)，酸溶性氮得率增長不顯著（P＞0.05）。分析其原因可能為酶解一定時(shí)間后，水解液中底物濃度、酶濃度等都發(fā)生一定的變化，使反應(yīng)條件逐漸脫離最佳酶解條件，造成酶解程度上升緩慢。此種情況可以通過監(jiān)控反應(yīng)過程中pH的變化，采用滴加酸堿液來保持反應(yīng)體系pH的恒定。為防止反應(yīng)體系的過度水解，結(jié)合生產(chǎn)成本考慮，綜合各因素確定水解時(shí)間為5h。

圖4 時(shí)間對酸溶性氮得率的影響Fig.4 Effect of time of enzymatic hydrolysis on yield of acid soluble nitrogen

2.5 南瓜籽仁粕酶解的工藝參數(shù)

以底物濃度、加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，以酸溶性氮得率為指標(biāo)，對南瓜籽仁粕粉酶解參數(shù)作正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表2 優(yōu)化酶解條件L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment on enzymatic hydrolysis conditions

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 The analysis of variance

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）及方差分析（表3）可知，南瓜籽仁粕酶解的影響因素主次順序?yàn)锽＞A＞C＞D，其中加酶量具有顯著影響，其它因素影響不顯著。直觀分析得出較優(yōu)組合為A2B2C3D1。極差分析得出較優(yōu)組合為A3B2C3D3，故進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明組合A2B2C3D1所得酸溶性氮得率（43.53%）高于組合A3B2C3D3所得酸溶性氮得率（42.23%），因此確定酶解最佳條件組合為A2B2C3D1，即：底物濃度1%，加酶量4%，酶解溫度60℃，酶解時(shí)間為4h。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)獲得的酸溶性氮得率為43.52%±0.39%。

2.6 南瓜籽仁蛋白多肽的抗氧化還原能力的測定

所得濃縮南瓜籽仁蛋白水解液中固形物（肽和氨基酸）含量可達(dá)（57.97±0.21）mg/mL。

在還原能力測定實(shí)驗(yàn)中，來自樣品中的抗氧化劑能將鐵氰化鉀中的Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+進(jìn)一步生成在700nm處有最大吸光值的Perl普魯士蘭，因此測定700nm處吸光值的高低可以間接反映抗氧化劑還原能力的大小[17]。將不同濃度南瓜籽仁多肽的吸光度與相應(yīng)濃度VC的吸光度進(jìn)行比較，可得出南瓜籽多肽的抗氧化能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 南瓜籽多肽的抗氧化能力Fig.5 Antioxidant activity of pumpkin seed peptide

從圖5可以看出，不同濃度的VC與南瓜籽仁多肽都有一定的吸光度。一般情況下，樣品的還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)[18]，說明不同濃度的VC與南瓜籽仁多肽都有一定抗氧化活性。如圖5所示，南瓜籽仁多肽樣品在低濃度下吸光值比較小，說明還原能力比較差，5.00～20.00mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加，南瓜籽仁多肽的還原能力有較好的量效關(guān)系。而VC的在濃度達(dá)到1mg/mL之前，抗氧化能力隨濃度的增大而增強(qiáng)；濃度達(dá)到1mg/mL之后，其抗氧化能力則有緩慢下降的趨勢，說明VC在適宜的濃度范圍內(nèi)有較好的還原能力，并非濃度越高還原能力越好，與朱艷華[19]的研究結(jié)果一致。在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，南瓜籽仁多肽的抗氧化能力比VC低，當(dāng)濃度達(dá)到20mg/mL時(shí)，南瓜籽仁多肽的抗氧化能力是VC的20.98%。

3 結(jié)論

3.1 實(shí)驗(yàn)得出，用木瓜蛋白酶酶解脫脂南瓜籽仁粕制備南瓜籽仁多肽的優(yōu)化工藝條件為：蛋白底物濃度為1%，加酶量4%，酶解溫度60℃，酶解時(shí)間4h。加酶量為反應(yīng)顯著影響因素。在最優(yōu)條件下所得濃縮南瓜籽仁蛋白水解液中固形物（肽和氨基酸）含量可達(dá)（57.97±0.21）mg/mL，酸溶性氮得率達(dá)43.52%±0.39%。

3.2 以VC作對照，南瓜籽仁多肽與VC相比有一定的抗氧化活性，但抗氧化活性較VC差。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著南瓜籽仁多肽濃度的增加，其抗氧化能力增強(qiáng)；在濃度加至20mg/mL時(shí)，南瓜籽仁多肽還原能力是VC的20.98%，并有繼續(xù)上升的趨勢。

[1]楊新建，宋琳琳.南瓜籽油的萃取工藝條件及其性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（1）：263－264.

[2]Bombardelli E，Morazzni P.Cucurbita pepol[J].Fitoterapia，1997，68（4）：291－302.

[3]Tsai Y S，Tong Y C，Cheng J T，et al.Pumpkin seed oil and phytosteml－F can block testostemne/prazosin－induced prostate growth in rats[J].Urollnt，2006，77（3）：269－274.

[4]張芳，蔣作明.南瓜的功能特性及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2000，21（6）：62－63.

[5]Nkosi C Z，Opoku A R，Terblanche S E.Antioxidative effects of pumpkin seed （Cucurbita pepo）protein isolate in CCl4－induced liver injury in low－protein fed rats[J].Phytother Res，2006，20（11）：935－940.

[6]李燕杰，甄成，陳洪濤，等.南瓜籽餅粕蛋白的綜合利用[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（8）：173－175.

[7]李紅敏，周小理.蕎麥多肽的制備及其抗氧化活性的研究[J].食品科學(xué)，2006，27（10）：302－306.

[8]王長青，任海偉.小黑豆多肽加工工藝的研究[J].食品科學(xué)，2008，29（5）：231－233.

[9]周利亙，陳新峰，王君虹，等.雙酶復(fù)合法制備大豆多肽工藝的研究[J].糧油食品科技，2006，14（2）：22－24.

[10]劉政，陶慧敏，黃躍，等.南瓜籽粕蛋白酶解低分子肽的研究[J].中國油脂，2009，34（11）：24－26.

[11]周利亙，陳新峰，王君虹，等.雙酶復(fù)合法制備大豆多肽工藝的研究[J].糧油食品科技，2006，14（2）：22－24.

[12]陳華潔，陳安國.肽的營養(yǎng)及其酶法生產(chǎn)的探索[J].飼料工業(yè)，2005，26（4）：41－44.

[13]邵偉，樂超銀，陳菽，等.大豆多肽的Alcalase酶解法制備工藝研究及應(yīng)用[J].中國釀造，2008（15）：69－71.

[14]肖凱軍，高孔榮，曾慶孝.木瓜蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究[J].食品科學(xué)，1995，16（8）：3－7.

[15]He Y H，Shahidi F.Antioxidant activity of green tea and its catechins in a fish meat model system[J].Agric Food Chem，1997，45（11）：4262－4266.

[16]翟瑞文，李雁群，陳子林，等.玉米面筋的酶水解[J].食品工業(yè)，1997（3）：7－8.

[17]Sreekanth K S，Sabu M C，Varghese L，et al.Antioxidant activity of smoke shield in－vitro and in－vivo[J].Pharm Pharmacol，2003，55：847－853.

[18]李翠蓮，方北曙，申雙貴.鷹嘴豆抗氧化多肽與其它抗氧化劑的協(xié)同作用[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008（10）：57－61.

[19]李艷華，譚軍.玉米多肽抗氧化作用的研究[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2008，23（1）：36－39.

Preparation of pumpkin seed peptide by enzymatic hydrolysis and its antioxidative activity

ZHANG Shu-rong1，WU Yu1，LIANG Ye-xing1，ZHONG Geng1，2，*
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Engineering Technique Research Center of Chongqing for Special Food，Chongqing 400715，China）

The preparation of pumpkin seed peptide with enzyamtic hydrolysis was studied，acid soluble nitrogen was used as a evaluating target.The optimal conditions of the process were obtained by orthogonal experiment as follows：substrate concentration 1%，enzyme dosage 4%，incubate temperature 60℃，and time 4h.Under these conditions，experiment validates that acid soluble nitrogen yield was 43.52%±0.39%.And the antioxidative activity of the peptide was more than 20%of that of VC.

pumpkin seed meal；enzymatic hydrolysis；peptides；antioxidative activity

TS255.1

B

1002-0306（2012）03-0241-04

2011－02－11 *通訊聯(lián)系人

張淑蓉（1985-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂工程。

重慶市高校優(yōu)秀科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（KJZH08221）。