C18-磁性納米顆粒萃取蝦肉中氯霉素殘留

王西麗，陳巧燕，李金峰，李 穎，薛 峰，蔣 原，朱 海

(1.深圳市易瑞生物技術有限公司，廣東深圳 518102;2.深圳市晨光乳業(yè)有限公司，廣東深圳 518107;3.江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，南京 210001)

獸藥對于治療和預防動物疾病發(fā)揮著積極的作用，為促進動物生長、保證動物的規(guī)?；B(yǎng)殖和加工創(chuàng)造了條件。但獸藥的濫用或非法使用造成的殘留，對人類具有明顯的急、慢性毒性，如致癌、致敏、遺傳毒性(致胎兒畸形)、體內(nèi)蓄積、免疫抑制與耐藥性等。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，氯霉素是一種被廣泛使用的廣譜抗菌藥，曾廣泛用于治療各種敏感菌感染，然而由氯霉素殘留引起的嚴重危害越來越受到人們的重視。例如對造血系統(tǒng)有嚴重不良反應，故對其臨床應用現(xiàn)已做出嚴格控制。氯霉素用于食用動物飼養(yǎng)和治療被中國及其他許多國家所嚴格禁止。

藥物殘留分析因具有待測藥物濃度低且波動范圍大、樣品基質復雜、干擾物質多、樣品基質和待測組分的不確定性等特點，傳統(tǒng)意義上的化學分析方法通常不能獨立進行［1］。樣品前處理一般分為提取、凈化、濃縮和衍生化4個部分［1］。樣品前處理的好壞直接影響到分析的各項指標、成本和效率［2］。

固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫達到分離和富集目標化合物的目的。與液-液萃取相比，固相萃取不需大量互不相溶的溶劑，處理過程中不會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，它采用高效、高選擇性的吸附劑，可以凈化很小體積的樣品，能顯著減少溶劑的用量，簡化樣品處理過程，同時降低成本。目前，納米材料(特別是磁性納米材料)因具有大的比表面積、可以有效提高回收效率［3-4］，使之在藥殘檢測的樣品前處理應用中越來越受到關注［3-4］。磁性納米顆粒已經(jīng)廣泛應用于核酸純化［5］、蛋白分離［6］、小分子檢測［4，7-8］等領域。本研究合成表面經(jīng)C18修飾的具有超順磁性的雙功能納米顆粒，以氯霉素作為提取對象，建立了一種利用C18-磁珠萃取樣品中氯霉素殘留的方法，并進行了初步評價。

1 實驗材料及儀器

甲醇(HPLC級)、乙酸乙酯(HPLC級)均為Fisher公司產(chǎn)品，甲酸(HPLC級)為Tedia公司產(chǎn)品，正己烷(HPLC級)為 Dikma公司產(chǎn)品，氨水(25% ～28%)、氯化鐵(AR級)、氯化亞鐵(AR級)、甲苯(AR級)、氯化鈉(AR級)為廣州化學試劑廠產(chǎn)品，二甲基十八烷基氯硅烷(AR級)為Alfa Aesar公司產(chǎn)品，氯霉素標準品購自Sigma公司，無水硫酸鈉(AR級)為北京化工廠產(chǎn)品。

超高效液相色譜儀(ACQUITY RTMUltra Performance LC)、質譜儀(Quattro Premier XE MSMS)、ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm) 均為 Waters 公司產(chǎn)品，0.45μm濾器(有機相)為上海邁博瑞生物膜技術有限公司產(chǎn)品，旋轉蒸發(fā)儀為IKA公司產(chǎn)品，Milli Q純水儀為密理博公司產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 Fe3O4超順磁性納米顆粒的制備 稱取27.1 g FeCl3·6H2O和11.78 g FeCl2·4H2O于500 mL去離子水中溶解。高速攪拌下，加入37 mL氨水，繼續(xù)高速攪拌30 min;磁力吸附，去除上層液體;用2 L水洗滌顆粒三次;將該顆粒定容至500 mL。

2.2 Fe3O4@SiO2超順磁性顆粒的制備 將上述所得Fe3O4顆粒超聲15 min，邊攪拌邊以0.5 mL/min的速度加入84 mL硅酸鈉，隨后以1 mL/min的速度逐滴加入1 mol/L鹽酸135 mL;磁力吸附，去除上層液體;用2 L水洗滌顆粒5次;將磁珠置于60℃真空干燥箱中干燥24 h。

2.3 磁珠的表面修飾［4］取上述顆粒0.05 g，超聲分散于20 g甲苯中，隨后加入0.5 g二甲基十八烷基氯硅烷、0.5 g吡啶，室溫下機械攪拌10 h。磁吸附，分別用乙醇和水洗滌顆粒若干次。將磁珠置于60℃真空干燥箱中干燥24 h。將磁珠重懸于10%的甲醇中，制成10 mg/mL的懸液，4℃保存，備用。

2.4 獸藥殘留磁珠提取方法的建立

2.4.1 結合溫度及時間的優(yōu)化 將120 μL磁珠添加到1 mL氯霉素標準溶液(10 μg/mL)中，渦旋混勻，置于旋轉混合儀上，分別于30℃、40℃、50℃條件下，結合 1、2、3、4、5 min;磁力吸附，去除上清;加入1 mL超純水，渦旋混勻，去除上清，重復本步操作一次;加入1 mL甲醇，渦旋混勻，磁力吸附，取上清于潔凈離心管中，重復本操作兩次，合并上清;用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液2 mL，加入2 mL水，混勻，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定(參照SN/T 1864-2007進行)。

2.4.2 磁珠用量優(yōu)化 將 60、80、100、120、140、160 μL磁珠添加到1 mL氯霉素標準溶液(10 μg/mL)中，渦旋混勻，置于旋轉混合儀上，置于50℃結合5 min;磁力吸附，去除上清;加入1 mL超純水，渦旋混勻，去除上清，重復本步操作一次;加入1 mL甲醇，渦旋混勻，磁力吸附，取上清于潔凈離心管中，重復本操作兩次，合并上清;用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液2 mL，加入2 mL水，混勻，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定(參照SN/T 1864-2007進行)。

2.4.3 線性范圍及檢出限的確定 參照標準方法，添加不同量的氯霉素到空白蝦肉樣品中，用磁珠法回收，每個濃度重復回收5次，取其平均值，以峰面積為縱坐標、加標樣品濃度為橫坐標制作標準曲線。具體方法如下：①制樣、提?。簠⒄?SN/T 1864-2007進行。②凈化：將100 μL磁珠添加到上述所得的4 mL水溶液中，渦旋混勻，置于旋轉混合儀上，置于50℃結合5 min;磁力吸附，去除上清;加入1 mL超純水，渦旋混勻，去除上清，重復本步操作一次;加入1 mL甲醇，渦旋混勻，磁力吸附，取上清于潔凈離心管中，重復本操作兩次，合并上清;收集濾液，加入等體積水，混勻，用0.45 μm 濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。③檢測：參照SN/T 1864-2007進行。

2.5 精密度實驗 對添加不同量氯霉素的空白樣品進行重復提取，重復提取5次(參照2.4.3項進行)，液相色譜-串聯(lián)質譜儀檢測，計算相對標準偏差(RSD)。

2.6 加標回收實驗 添加不同濃度的標準溶液至空白樣品中進行提取，并用磁珠法和標準法重復回收3次(參照2.4.3項進行)，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

3 結果

3.1 表征 圖1為C18鍵合磁珠的透射電鏡照片，由圖1可以看出，顆粒近似球形，粒徑大小約為300 nm。圖2為C18鍵合磁珠在磁場作用下和不在磁場作用下圖片。

圖1 C18修飾磁珠掃描電鏡照片

3.2 獸藥殘留磁珠前處理方法的建立

3.2.1 磁珠結合時間與結合溫度的優(yōu)化 圖3為用磁珠法回收氯霉素標準品柱狀圖，從圖中可以看出，隨著溫度的升高，回收率越來越高，隨著結合時間的延長，回收率也越來越高。50℃結合5 min時，基本達到飽和狀態(tài)。因而，將磁珠的結合時間定為5 min，結合溫度定為50℃。

3.2.2 磁珠用量優(yōu)化 往1 mL 10 μg/mL的氯霉素標準品中添加 60、80、100、120、140、160 μL 磁珠，圖4為回收效果圖。從圖中可以看出，隨著磁珠量的增加，回收率也在增加，當磁珠的量達到120 μL以后，回收率不再增加，因此，將磁珠的添加量定為 120 μL。

圖4 磁珠用量優(yōu)化

3.3 線性范圍及檢出限的確定 參照標準方法，添加不同量的氯霉素到空白蝦肉樣品中，用磁珠法回收，每個濃度重復回收5次。圖5為氯霉素回收標準曲線，方法的線性范圍0.1～10 μg/kg，標準曲線是 y=13707x+5530.8，R2=0.9941，以信噪比S/N=3為檢出限，本方法的最低檢出限為0.1 μg/kg。

圖5 氯霉素標準曲線

3.4 精密度實驗 對添加不同量氯霉素的空白樣品進行重復提取，重復提取5次，液相色譜-串聯(lián)質譜儀檢測，計算相對標準偏差(RSD)。0.1 μg/kg加標樣品的RSD 為5.7%;0.2 μg/kg加標樣品的 RSD為6.3%;0.5 μg/kg 加標樣品的 RSD 為4.8%。

3.5 加標回收實驗 往空白蝦肉中添加不同量的氯霉素，分別用標準法和磁珠法進行回收，每個濃度重復提取3次，計算平均回收率。結果見表1。從表中可以看出兩種方法的回收率基本一致，整體上看，標準法的回收率略高于磁珠法。

表1 加標回收實驗 %

4 討論

4.1 超順磁性納米顆粒的合成 目前，用于制備超順磁性納米顆粒的材料有很多種，如Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O4(Me=Co、Mn、Ni)、金屬 Ni、Co、Fe等，其中，又以Fe3O4應用最為廣泛。本研究中，三價鐵和二價鐵在堿性條件下共沉淀，獲得了具有超順磁性的納米顆粒，并在其表面包裹一層二氧化硅。二氧化硅層的形成對超順磁性的納米顆粒有著極其重要的意義［4］：①二氧化硅層有效防止了納米Fe3O4顆粒之間的聚集;②二氧化硅表面存在著豐富的硅醇基，易于被活化，從而易于在顆粒的表面引入各種功能基團;③二氧化硅是一種惰性材料，不易與其他物質反應。硅烷偶聯(lián)劑因其易于與二氧化硅表面的硅醇基反應，因而在各個領域得到廣泛應用。本研究將二甲基十八烷基氯硅烷與顆粒表面的硅醇基反應，從而在顆粒表面引入了十八烷基，獲得了一種高效的雙功能納米顆粒。

4.2 獸藥殘留磁珠法提取方法的建立 本研究以氯霉素為研究對象，建立了一種以C18鍵合磁珠萃取蝦肉中氯霉素的方法，代替標準方法中的C18柱固相萃取法，操作簡單，更有利于待測樣品的大批量、自動化前處理。實驗結果表明，磁珠法回收氯霉素的線性范圍 0.1 ～ 10 μg/kg，標準曲線是y=13707x+5530.8，R2=0.9941，以信噪比 S/N=3為檢出限，最低檢出限為0.1 μg/kg，完全能夠滿足檢測需要。

［1］屈常林，王懷娜.獸藥殘留分析中樣品前處理技術新進展［J］.山東畜牧獸醫(yī)，2010，1：54-55.

［2］張俊升，譚 梅，楊建鳴，等.獸藥殘留分析中樣品前處理方法綜述［J］.中國動物保健，2009，6：60-62.

［3］Song Y，Zhao S，Tchounwou P，et al.A nanoparticle-based solid-phase extraction method for liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometric analysis［J］.J Chromatogr A，2007，1166：79-84.

［4］Sha Y，Deng C，and Liu B.Development of C18-functionalized magnetic silica nanoparticles as sample preparation technique for the determination of ergosterol in cigarettes by microwave-assisted derivatization and gas chromatography/mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2008，(1198-1199)：27-33.

［5］Nagy M，Otremba P，Kruger C，et al.Optimization and validation of a fully automated silica-coated magnetic beads purification technology in forensics［J］.Forensic Sci Int，2005，152：13-22.

［6］Li Y，Qi D，Deng C，et al.Cerium ion-chelated magnetic silica microspheres for enrichment and direct determination of phosphopeptides by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry［J］.J Proteome Res，2008，7：1767-1777.

［7］Ballesteros-Gomez A，Rubio S.Hemimicelles of alkyl carboxylates chemisorbed onto magnetic nanoparticles：study and application to the extraction of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons in environmental water samples［J］.Anal Chem，2009，81：9012-9020.

［8］Morales-Cid G，F(xiàn)ekete A，Simonet B M，et al.In situ synthesis of magnetic multiwalled carbon nanotube composites for the cleanup of(fluoro)quinolones from human plasma prior to ultrahigh pressure liquid chromatography analysis［J］.Anal Chem，2010，82：2743-2752.