北京地區(qū)健康肉雞攜帶沙門氏菌狀況調(diào)查

張純萍，寧宜寶，宋 立，陳惠娟，習(xí) 碩，袁 欣

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.揚州大學(xué)，江蘇揚州 225009;3.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206)

沙門氏菌是一種重要的人畜共患病原微生物，它不僅能夠引起雞的各種疾病，而且感染雞耐過后經(jīng)常成為隱性帶菌者，不定期排毒，從而感染其他雞只并污染周圍環(huán)境，對肉雞的養(yǎng)殖造成很大危害。更為重要的是，肉雞所攜帶的沙門氏菌也是一種重要的食源性病原菌。研究［1-2］表明，人感染腸炎沙門氏菌主要是由于食用了被污染的禽蛋和禽肉所引起。

沙門氏菌血清型眾多，目前已經(jīng)鑒定出2500多種血清型。不同國家、不同地區(qū)雞群中的優(yōu)勢血清型不同，不同血清型的沙門氏菌對雞和人的致病性也不相同。全球食源性監(jiān)測網(wǎng)的檢測結(jié)果表明［3］，引起公共衛(wèi)生安全的沙門氏菌主要以腸炎和鼠傷寒兩種血清型為主。肉雞作為人腸炎沙門氏菌感染的主要來源，美國和歐盟等西方發(fā)達國家早在20世紀(jì)90年代就已經(jīng)開展了對食品動物中沙門氏菌病流行性的調(diào)查，而且每年都會發(fā)布監(jiān)測結(jié)果報告;歐盟還制定了肉雞腸炎沙門氏菌的嚴(yán)格控制措施和控制目標(biāo)［4-5］，但目前國內(nèi)對肉雞中沙門氏菌流行狀況的研究和調(diào)查資料很少。鑒于此，本研究從2010年4月至2011年10月期間共采集北京地區(qū)28個肉雞養(yǎng)殖場的健康肉雞盲腸或泄殖腔拭子樣品1310份，分離其中的沙門氏菌并進行血清型鑒定，以了解北京地區(qū)健康肉雞沙門氏菌的攜帶情況，從而為北京地區(qū)肉雞場沙門氏菌病的防控和首都的公共衛(wèi)生安全提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 待宰肉雞泄殖腔拭子或屠宰場肉雞的盲腸樣品共1310份，分別采自北京市順義、海淀、懷柔、延慶、平谷等區(qū)縣28個肉雞養(yǎng)殖場的健康肉雞(41～49日齡)，其中每個肉雞養(yǎng)殖場采樣40～50份。樣品采集后4 h內(nèi)分離沙門氏菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 亞硝酸鹽胱氨酸(SC)、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和XLT4培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;四硫磺酸鈉煌綠(TTB)購自英國Oxoid公司;營養(yǎng)瓊脂由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.3 沙門氏菌診斷血清(全套193支) 購于泰國S＆A公司。

1.1.4 分子試劑 PCR buffer、dNTP和 GoTaq DNA聚合酶均由普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司提供;DL2000 DNA Marker購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.5 引物合成與測序 分別由英俊生物技術(shù)有限公司北京合成部和北京測序部完成。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌的分離與鑒定 根據(jù)本實驗室建立的方法［6］進行沙門氏菌的分離，具體為：將泄殖腔拭子或者盲腸樣品用SC和TTB增菌液進行常規(guī)增菌培養(yǎng)，然后分別取1環(huán)增菌液劃線接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和XLT4培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，可疑菌落用營養(yǎng)瓊脂進一步純化。

純化后的菌落用PCR方法［7］進行鑒定。擴增目的片段invA基因的長度為284 bp，上下游引物(5'-3')分別為：gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa和tca tcg cac cgt caa agg aac c，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳后進行凝膠成像分析。

1.2.2 沙門氏菌的血清分型 將沙門氏菌接種營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜后根據(jù)泰國血清的操作說明和國標(biāo)中沙門氏菌的檢驗方法［8］分別進行菌體(O)抗原和鞭毛(H)抗原的檢測，以生理鹽水作為陰性對照，與試驗抗血清出現(xiàn)凝集反應(yīng)者即判定為陽性。根據(jù)O抗原和H抗原的檢測結(jié)果，參照沙門氏菌屬抗原表［9］判定血清型，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果 本研究總共從1310份樣品中分離鑒定出沙門氏菌54株，總分離率為4.1%。不同養(yǎng)殖場沙門氏菌的分離情況不同，在所采樣的28個肉雞養(yǎng)殖場中，僅從其中的15個養(yǎng)殖場(53.6%)分離到了沙門氏菌，而其余13個養(yǎng)殖場(46.4%)均未分離到沙門氏菌，這15個沙門氏菌陽性肉雞場的分離情況見表1。由表1可見，15個沙門氏菌陽性肉雞場中沙門氏菌的攜帶情況差異很大，攜帶率在2.0% ～16.0%之間。

表1 15個陽性肉雞場沙門氏菌的分離情況和血清分型結(jié)果

2.2 沙門氏菌的血清分型 15個陽性肉雞場沙門氏菌的血清型分布見表1。由表1可知，不同肉雞養(yǎng)殖場沙門氏菌的血清型分布不同，但是大多數(shù)肉雞養(yǎng)殖場中分離的沙門氏菌均集中于1～2個血清型?？傮w來看，在所分離的54株沙門氏菌中，腸炎(S.enteritidis)(31.5%)和爪哇安那(S.javiana)(25.9%)為兩種優(yōu)勢血清型，其次是禽傷寒(S.gallinarum)(9.3%)和馬流產(chǎn)(S.abortusequi)(5.6%)沙門氏菌。本研究尚分離到6株II型(薩拉姆亞種，即S.enterica subsp.salamae)和5株不可分型的沙門氏菌。

3 討論

3.1 健康肉雞沙門氏菌的攜帶情況 根據(jù)北京地區(qū)肉雞養(yǎng)殖場的分布情況，本研究共調(diào)查了該地區(qū)具有代表性的28個養(yǎng)殖場健康肉雞體內(nèi)沙門氏菌的流行情況，并從其中15個養(yǎng)殖場中分離到了沙門氏菌?？傮w來看，本研究中健康肉雞沙門氏菌的平均攜帶率為4.1%，陽性肉雞養(yǎng)殖場的平均分離率為7.4%，這與其他國家的研究結(jié)果相似。歐盟27個成員國在2009年和2010年對肉雞進行的沙門氏菌監(jiān)測結(jié)果表明，其平均帶菌率分別為5.0%和4.1%［10］;越南對302份肉雞糞便樣品進行沙門氏菌的檢測，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌的攜帶率為7.9%［11］。

本研究中不同養(yǎng)殖場的分離率之間存在較大偏差，這說明健康成雞體內(nèi)沙門氏菌的攜帶情況與養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理密切相關(guān)［1］。由于禽傷寒、腸炎等血清型的沙門氏菌可通過種雞垂直傳播，因此該分離結(jié)果也可能與種雞的沙門氏菌攜帶以及種蛋的污染情況直接相關(guān)。歐盟的研究結(jié)果表明，2009年和2010年平均分別有2.4%和1.6%的父母代肉種雞感染了沙門氏菌［10］，在我國雖然沒有具體的感染率調(diào)查報道，但是種雞與種蛋的沙門氏菌污染水平也不容忽視。

3.2 沙門氏菌的血清型分布 從種屬關(guān)系來分，沙門氏菌可以分為邦戈爾和腸道兩個種，腸道沙門氏菌又分為以下6個亞種：腸道亞種、薩拉姆亞種、亞利桑那亞種、雙相亞利桑那亞種、浩敦亞種和因迪卡亞種。根據(jù)沙門氏菌菌體(O)抗原、莢膜(Vi)抗原和鞭毛(H)抗原的不同，又可將沙門氏菌分為許多血清型。2007年的WHO抗原表［9］中已經(jīng)包含2579種血清型，其中絕大多數(shù)為腸道沙門氏菌(僅有22種屬于邦戈爾沙門氏菌)。在2557種腸道沙門氏菌中，僅腸道亞種具有具體的血清型名稱(1531個血清型)，其余5個亞種的血清型均以亞種名稱表示。在本研究中，除了11株沙門氏菌(5株不可分型和6株II型)外，其余從健康肉雞體內(nèi)分離的沙門氏菌均屬于腸道亞種。

本研究中不同養(yǎng)殖場沙門氏菌的血清型分布不同，但是整體來看，最常見的為腸炎沙門氏菌，這與大多數(shù)國家所分離到的優(yōu)勢血清型基本一致。美國2010年從肉雞中分離的沙門氏菌主要以腸炎和肯塔基血清型為主［12］;而歐盟2010年分離的主要血清型為腸炎和鴨沙門氏菌［10］。本研究中位居第2的血清型為爪哇安那，占比25.9%，這與越南2001年的沙門氏菌血清型檢測結(jié)果［11］類似，但是在美國和歐盟流行性位居前10的沙門氏菌血清型中均未發(fā)現(xiàn)該血清型，因此爪哇安那沙門氏菌的攜帶可能具有地區(qū)性的特點。

研究表明，在大多數(shù)國家，90%以上的沙門氏菌都屬于30種左右的血清型［3］，但是近年來有些很少見的血清型又有增加的趨勢［13］。在本研究中，除II型和不可分型的沙門氏菌外，共分離到8個血清型的沙門氏菌;并且大多數(shù)肉雞養(yǎng)殖場中分離的沙門氏菌均集中于1～2個血清型，這可能與養(yǎng)殖場長期持續(xù)存在該血清型的感染或者種雞來源相關(guān)。由于不同地區(qū)沙門氏菌的血清型分布差異很大，因此非常有必要對全國不同地區(qū)肉雞沙門氏菌的血清型分布進行系統(tǒng)詳細的監(jiān)測，以了解全國肉雞沙門氏菌的攜帶情況。

本研究調(diào)查了北京地區(qū)健康肉雞體內(nèi)沙門氏菌的攜帶情況，為開展全國性的沙門氏菌流行病學(xué)調(diào)查研究打下了良好的基礎(chǔ)，并為北京地區(qū)肉雞場沙門氏菌病的防控和公共衛(wèi)生安全提供了資料和技術(shù)支持。

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