光纖生物傳感器檢測嗜肺軍團(tuán)菌方法的建立

宋玲玲 陳蘇紅 張敏麗 張宏剛 肖 瑞 王升啟

1.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

光纖生物傳感器檢測嗜肺軍團(tuán)菌方法的建立

宋玲玲1陳蘇紅2張敏麗2張宏剛2肖 瑞2王升啟2

1.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

目的 建立光纖生物傳感器檢測嗜肺軍團(tuán)菌的方法，為嗜肺軍團(tuán)菌提供一種快速、現(xiàn)場的檢測手段。 方法 先用抗原或抗體包被光纖，再加入待測物質(zhì)孵育6～10 min，最后加入熒光探針反應(yīng)6～10 min，根據(jù)理化換能元件可以將熒光信號轉(zhuǎn)換成電信號的原理，實(shí)現(xiàn)對樣品的定性或定量檢測目的。同時探討了光纖修飾方法，包被緩沖液以及離子強(qiáng)度等因素對實(shí)驗結(jié)果的影響。 結(jié)果 光纖生物傳感器法檢測嗜肺軍團(tuán)菌時，最低可檢測到3×104cfu/mL，檢測響應(yīng)時間為20 min；傷寒沙門菌、大腸桿菌、結(jié)核桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌的檢測結(jié)果均為陰性，顯示出良好的特異性。 結(jié)論 光纖生物傳感器檢測嗜肺軍團(tuán)菌時，表現(xiàn)出快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可作為嗜肺軍團(tuán)菌的一種初篩方法。

嗜肺軍團(tuán)菌；光纖生物傳感器；光纖修飾

嗜肺軍團(tuán)菌是一種革蘭陰性桿菌，為條件致病菌，是生物恐怖劑的一種，能引起高死亡率的軍團(tuán)病，自從1976年發(fā)現(xiàn)它能夠引起人類疾病以來，已經(jīng)造成了上萬人死亡[1]。目前，嗜肺軍團(tuán)菌主要的檢測方法包括細(xì)菌培養(yǎng)法、血清學(xué)檢測方法、PCR法等[2]，其中，細(xì)菌培養(yǎng)法具有價格昂貴、耗時長、對人員技術(shù)要求比較高并且容易造成實(shí)驗操作人員感染等缺點(diǎn)；血清學(xué)檢測方法雖然操作快捷，但靈敏度低并且容易與其他菌存在非特異性結(jié)合；PCR法雖然靈敏度高，但是耗時長，操作復(fù)雜，需要昂貴的儀器設(shè)備，不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測。因此，迫切需要一種快速、特異、靈敏的嗜肺軍團(tuán)菌檢測方法。然而，光纖生物傳感器具有快速、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡單、攜帶方便可以進(jìn)行現(xiàn)場檢測等優(yōu)點(diǎn)，可作為嗜肺軍團(tuán)菌的一種初篩方法。本文建立了光纖生物傳感器法并利用雙抗體夾心的反應(yīng)模式對嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行了檢測，同時對其特異性、靈敏度、重復(fù)性等進(jìn)行了評價，旨在建立一種快速、特異、靈敏并能夠?qū)κ确诬妶F(tuán)菌實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

丙酮、冰醋酸、30%的氫氟酸、30%過氧化氫、95%乙醇、50%戊二醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、硫酸購自北京興青紅精細(xì)化學(xué)品科技有限公司；（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTS）、牛血清白蛋白（BSA）購自 Sigma公司；氨水購自西隴化工股份有限公司；硫酸-重鉻酸鉀洗液、光纖探頭為實(shí)驗室自制；超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱購自重慶萬達(dá)儀器有限公司。

1.2 抗體與細(xì)菌

兔 IgG（拜爾迪生物科技有限公司），抗兔 IgG·Cy3（abcam），鼠抗軍團(tuán)單抗（meridian），大腸埃希菌 O157（分離株），兔抗軍團(tuán)多抗（abcam），Cy3 試劑盒（GE Healthcare）；嗜肺軍團(tuán)菌（分離株），傷寒沙門菌（50097），痢疾志賀菌（分離株），結(jié)核分枝桿菌（標(biāo)準(zhǔn)株HRv37），小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（分離株），霍亂弧菌 O139（標(biāo)準(zhǔn)株），金黃色葡萄球菌（ATCC25923），上述所有細(xì)菌均由浙江省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.3 方法

1.3.1 光纖探頭的制備與修飾

1.3.1.1 光纖探頭的制備 先將光纖截成10 cm長并把兩端磨平，再用手術(shù)刀將光纖從一端削去6.5 cm長包層，然后將削去包層的一端浸入30%的氫氟酸中腐蝕2～3 h直至被腐蝕部分的直徑為（225±5）μm，保證光纖探頭錐形部分的長度約為0.5 cm，最后將剩余的包層削去備用。

1.3.1.2 光纖探頭的修飾 光纖作為生物傳感器中的敏感元件，它修飾效果的好壞直接關(guān)系著實(shí)驗結(jié)果的成敗，本實(shí)驗室比較了兩種光纖修飾方法。方法1[3]：①光纖的清洗：將探頭放入 piraha 溶液（濃 H2SO4∶H2O2=3∶1）浸泡 30 min，用超純水進(jìn)行充分清洗后，置于105℃干燥箱中干燥5 h；②氨基化修飾：將潔凈的探頭放入含2%的APTS丙酮溶液中反應(yīng)1 h，先用丙酮清洗3次，再用超純水充分清洗近中性；③醛基化修飾：將光纖放入5.0%（V/V）的戊二醛PBS溶液中，在37℃反應(yīng)1 h后，用超純水沖洗3次備用。方法2[4]：①光纖的清洗：將探頭放入 piraha 溶液（濃 H2SO4∶H2O2=3∶1）浸泡 30 min，用超純水進(jìn)行充分清洗后，再置于105℃干燥箱中干燥5 h；②氨基化修飾：將光纖放入含1%APTS的乙醇溶液在室溫反應(yīng)25 min；再分別用乙醇和去離子水各超聲清洗5 min，最后將清洗過的光纖置于115℃烘箱中干燥60 min；③醛基化修飾：將光纖放入10%的戊二醛水溶液中室溫反應(yīng)40 min；用去離子水超聲清洗3次，每次5 min，最后將光纖室溫干燥備用。

1.3.2 光纖的包被與檢測

將修飾好的光纖浸入含一定濃度的抗原 （或抗體）的PBS溶液中于4℃包被過夜，然后用2 mg/mL的BSA封閉光纖1 h減少非特異吸附。將封閉好的光纖裝入反應(yīng)池內(nèi)，先用PBS-T（含0.05%Tween-20）沖洗50 s，然后通過蠕動泵加入待檢測物質(zhì)反應(yīng)6～10 min；再用PBS-T沖洗50 s，最后通過蠕動泵加入熒光探針反應(yīng)6～10 min，通過傳感器中理化換能元件可以將免疫復(fù)合物的熒光信號轉(zhuǎn)換成電信號的原理，從而實(shí)現(xiàn)樣品的定性或定量檢測。

1.3.3 嗜肺軍團(tuán)菌的檢測

先按照Cy3試劑盒的說明書對兔抗軍團(tuán)多抗進(jìn)行Cy3標(biāo)記，然后用透析的方法除去多余的Cy3，備用。包被好0.05 mg/mL鼠抗軍團(tuán)單抗的光纖插入反應(yīng)池中，然后用PBS-T（含0.05%Tween-20）沖洗50 s，最后加入嗜肺軍團(tuán)菌和兔抗軍團(tuán)多抗·Cy3的混合液反應(yīng)10 min，并記錄實(shí)驗結(jié)果。通過對梯度稀釋的嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測，從而對其靈敏度進(jìn)行評價。以傷寒沙門菌、大腸桿菌、結(jié)核桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌進(jìn)行特異性檢測。所有實(shí)驗均重復(fù)3次以上，取結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果

2.1 光纖修飾效果的比較

以采樣時間（s）為橫坐標(biāo)，以信號值（MV）為縱坐標(biāo)作圖。結(jié)果如圖1所示，用方法2修飾的光纖的信號值明顯高于方法1，表明第2種方法比第1種方法修飾的光纖共價結(jié)合能力強(qiáng)。

2.2 包被液的優(yōu)化

本研究比較了0.01 mol/L pH 5.0的醋酸鹽溶液、0.01 mol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液、0.01 mol/L pH 9.6的碳酸鹽溶液3種緩沖液的包被效果。結(jié)果如圖2所示，0.01 mol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液作為包被緩沖液時，信號值最強(qiáng)，包被效果最好。

2.3 包被液離子強(qiáng)度的優(yōu)化

本研究比較了 0.01、0.02、0.05和 0.1 mol/L 4種離子強(qiáng)度的Tris-HCl溶液的包被效果。結(jié)果如圖3所示，Tris-HCl溶液的離子強(qiáng)度為0.01 mol/L時信號值最高，包被效果最好。

2.4 嗜肺軍團(tuán)菌檢測方法的建立

本實(shí)驗比較了兩種反應(yīng)模式，第1種反應(yīng)模式：先用鼠抗軍團(tuán)單抗包被光纖，再加入待測的嗜肺軍團(tuán)菌，然后加入兔抗軍團(tuán)多抗，最后加入熒光探針抗兔IgG·Cy3；第2種反應(yīng)模式：先用鼠抗軍團(tuán)單抗包被光纖，然后加入待測的嗜肺軍團(tuán)菌，最后加入兔抗軍團(tuán)多抗·Cy3。結(jié)果如圖4所示，直接用兔抗軍團(tuán)多抗·Cy3作為熒光探針時，信號值最高，實(shí)驗效果最好。因此，本研究最后確立，以雙抗體夾心的反應(yīng)模式對嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測，即以鼠抗軍團(tuán)單抗和兔抗軍團(tuán)多抗·Cy3分別作為捕獲抗體和檢測探針。

2.5 嗜肺軍團(tuán)菌方法的特異性評價

將濃度為1×107cfu/mL的傷寒沙門菌、大腸桿菌、結(jié)核桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌均稀釋到1×105cfu/mL并進(jìn)行特異性實(shí)驗。結(jié)果如圖5所示，用光纖生物傳感器對嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行檢測時，其與傷寒沙門菌、大腸桿菌、結(jié)核桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌不存在交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.6 檢測嗜肺軍團(tuán)菌方法的靈敏度評價

以10倍梯度稀釋濃度為3×102～3×105cfu/mL的嗜肺軍團(tuán)菌為模板進(jìn)行檢測，從而對其靈敏度進(jìn)行評價。結(jié)果判斷：當(dāng)信號值大于上述6種細(xì)菌和空白對照的+3SD（78 MV）時，檢測結(jié)果判為陽性；反之則判為陰性。結(jié)果如圖6所示，嗜肺軍團(tuán)菌最低可檢測到3×104cfu/mL。

2.7 檢測嗜肺軍團(tuán)菌方法的重復(fù)性評價

用同一批次和不同批次修飾的光纖包被鼠抗軍團(tuán)單抗，對嗜肺軍團(tuán)菌以及傷寒沙門菌、大腸桿菌、小腸耶爾森菌等6種細(xì)菌進(jìn)行多次實(shí)驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗜肺軍團(tuán)菌的檢測結(jié)果均為陽性且隨著菌濃度的降低，信號值也呈現(xiàn)明顯的梯度關(guān)系；同時其對傷寒沙門菌、大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、痢疾志賀菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核桿菌、霍亂弧菌的檢測結(jié)果均為陰性。見表1、2。

3 討論

光纖生物傳感器由激光器、生物樣品檢測部分和信號轉(zhuǎn)換裝置三部分組成，由于其具有檢測速度快、靈敏度高、生物特異性強(qiáng)、成本相對低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，近年來逐漸成為研究的熱點(diǎn)并被越來越多地用于微生物、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)學(xué)等方面[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，光纖的制備與修飾效果直接影響著實(shí)驗結(jié)果，光纖探針纖芯直徑的大小直接影響著包被效果和實(shí)驗的重復(fù)性，同時光纖探針的錐形的長度及錐度等直接影響著倏逝波的透射深度。因此，需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作方法來保證光纖修飾效果的一致性。本研究發(fā)現(xiàn)，將嗜肺軍團(tuán)菌與兔抗軍團(tuán)多抗·Cy3以一定的比例進(jìn)行混合可以大大提高檢測的靈敏度，反應(yīng)鏈的延長會顯著地降低實(shí)驗的靈敏度。

表1 特異性重復(fù)實(shí)驗結(jié)果（MV）

表2 靈敏度重復(fù)實(shí)驗結(jié)果（MV）

近年來，光纖生物傳感器從傳感器中異軍突起并顯示了其特有的優(yōu)勢，它未來的發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面：第一，由于納米材料具有體表面積比大，表面活性高，對生物大分子吸附作用強(qiáng)，傳導(dǎo)性好等優(yōu)點(diǎn)，它被更多地應(yīng)用在傳感器中作為固定的材料；第二，由于計算機(jī)、物理化學(xué)等學(xué)科的融入，光纖生物傳感器向小型化、智能化方向發(fā)展；第三，逐漸向產(chǎn)業(yè)化、商品化方向發(fā)展。隨著這些研究的深入，光纖生物傳感器有望成為一種嗜肺軍團(tuán)菌實(shí)時、在線和現(xiàn)場檢測的技術(shù)手段。

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Establishment of method of fiber optic biosensor for detection of Legionella Pneumophila

SONG Lingling1CHEN Suhong2ZHANG Minli2ZHANG Honggang2XIAO Rui2WANG Shengqi2
1.Chinese PLA Postgraduate Medical School,Beijing 100853,China;2.Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Sciences,Beijing 100850,China

Objective To establish the method of fiber optic biosensor for the detection of Legionella Pneumophila,in order to offer a fast,field detection mean for Legionella pneumophila.Methods At first,antigen or antibody was used to coat fibers;then the sample was added to incubate about 6 to 10 minutes;finally,the fluorescent probe was added to react 6 to 10 minutes.The purpose of qualitative or quantitative determination for the sample could be achieved,depending on the electrical signals converted from fluorescent signals by physicochemical transducer.Meanwhile,the effects of fiber modification methods,coated buffers and ionic strength on experimental results had been studied.Results When fiber optic biosensor used for Legionella pneumophila detection,its limit detection can achieve as low as 3×104CFU/mL and its response time was about 20 min.The detection results of Salmonella Typhi,Escherichia Coli,Mycobacterium Tuberculosis,Yersinia Enterocolitica,Vibrio Cholerae,Staphylococcus Aureus and Shigella Dysenteriae were all negative,which showed favourable specificity.Conclusion Fiber optic biosensor shows advantages of rapid,high sensitivity,good specificity and reproducibility in detection of Legionella pneumophila.It can be used as a screening method for Legionella pneumophila detection.

Legionella Pneumophila;Fiber optic biosensor;Fiber modification

R345

A

1673-7210（2012）06（c）-0023-03

國家自然科學(xué)基金（31100712）。

宋玲玲（1985-），女，碩士研究生，主要從事生物傳感器方面的研究。

肖瑞（1977-），女，助理研究員，主要從事生物傳感器方面的研究。王升啟（1962-），男，博士生導(dǎo)師，研究員，主要從事體外診斷試劑方面的研究。

2012-03-09 本文編輯：程 銘）