蜂膠對運動訓(xùn)練小鼠抗疲勞能力影響的研究

于 洋，韓曉燕，潘 燕

（1.沈陽體育學(xué)院運動人體科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽 110102;2.玉林師范學(xué)院體育系，廣西玉林 537000;3.湖北師范學(xué)院體育系，湖北黃石 435002）

蜂膠對運動訓(xùn)練小鼠抗疲勞能力影響的研究

于 洋1，韓曉燕2，潘 燕3

（1.沈陽體育學(xué)院運動人體科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽 110102;2.玉林師范學(xué)院體育系，廣西玉林 537000;3.湖北師范學(xué)院體育系，湖北黃石 435002）

目的:通過給訓(xùn)練小鼠灌服蜂膠，觀察蜂膠對訓(xùn)練小鼠紅細胞形態(tài)、血漿及心肌自由基代謝的影響，為蜂膠在運動領(lǐng)域的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法:健康KM小鼠30只，隨機分為安靜組、訓(xùn)練組、訓(xùn)練+蜂膠組。三組小鼠每日上午均灌胃:安靜組、訓(xùn)練組灌服蒸餾水;訓(xùn)練+蜂膠組按45mg/kg體重灌服蜂膠。訓(xùn)練組和訓(xùn)練+蜂膠組進行四周遞增強度的游泳訓(xùn)練。結(jié)果:①4周游泳訓(xùn)練組小鼠與安靜組相比，紅細胞畸形率、心肌、血漿MDA含量顯著增高，心肌、血漿SOD活性、紅細胞Na+－K+－ATP酶活性顯著降低;②訓(xùn)練+蜂膠組小鼠紅細胞畸形率、心肌、血漿MDA含量顯著低于訓(xùn)練組，心肌、血漿SOD活性、紅細胞Na+－K+－ATP酶、GSH－Px、Ca2+－ATP酶活性顯著高于訓(xùn)練組。結(jié)論:①經(jīng)過4周游泳訓(xùn)練后，小鼠機體脂質(zhì)過氧化程度加重，運動能力下降。②在4周的游泳訓(xùn)練過程中，給小鼠灌服蜂膠，可以明顯改善小鼠運動后的抗疲勞能力。

蜂膠;訓(xùn)練;抗疲勞

蜂膠的主要成分是黃酮類化合物，能夠提高抗氧化酶的活性，清除運動中產(chǎn)生的過量的自由基，是一種具有很大開發(fā)潛力的天然中藥材和天然保健食品，是公認的天然抗氧化劑。蜂膠已廣泛應(yīng)用于臨床，在運動領(lǐng)域的研究較少。因此通過給訓(xùn)練小鼠灌服蜂膠，觀察蜂膠對由運動源性自由基造成的血液、心肌、紅細胞形態(tài)和功能改變是否有保護作用，為蜂膠更好地應(yīng)用于運動領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

昆明（KM）小鼠30只，雌雄各半5周齡，體重18～23kg，由中國醫(yī)科大學(xué)動物中心購入。

1.2 分組與運動方式

小鼠購進后，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨機分3組，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲食、水，室內(nèi)溫度20～25℃，相對濕度50% ～60%，自然光照，通風良好。隔日更換墊料，鼠籠每周消毒2次。小鼠每日上午均灌胃，給藥方案見表1。

小鼠在長100cm、寬60cm、高70cm的玻璃泳缸中游泳，水深45cm，水溫控制在（32±2）℃，及時清理泳缸中的小鼠糞便以保證水質(zhì)，每次游泳結(jié)束后迅速烘干體毛。各運動組小鼠每周游泳6天，每次運動時間為第一周30min/d，第二周

60min/d，第三周 90min/d，第四周 120min/d。

表1 小鼠分組及給藥方案

1.3 樣本的收集和處理

所有小鼠在最后一次訓(xùn)練結(jié)束后次日摘眼球取血，肝素抗凝。取抗凝血350μL，置于彈頭試管中用于紅細胞Na+－K+－ATP酶活性及血紅蛋白的測試。余血1mL 1 500r/min離心10min，取上層液體（血漿）置于彈頭試管中，待測MDA含量和SOD活性。沉淀進一步處理。

紅細胞固定液的制備:下層沉淀加入0.86%NaCl，1 500 r/min離心10min，棄上清，重復(fù)洗滌3次。在沉淀中加入0.1mol/L磷酸緩沖液配制的0.2%戌二醛溶液，1 500r/min離心10min，使固定液與紅細胞分開，棄上清。再向沉淀中加入戊二醛固定液，置于0～4℃冰箱保存，待測紅細胞形態(tài)。

各組處死后，立即取出心臟，置于冰生理鹽水中清洗血液，用濾紙吸干，稱重、取樣，以0.9%生理鹽水作為介質(zhì)，低溫勻漿，取上清液測 SOD、MDA、GSH－Px、Ca2+－ATP酶。1.4 指標測定

心肌、血漿 MDA、SOD、紅細胞 Na+－K+－ATP酶、GSH－Px、Ca2+－ATP酶都是用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測試，測試過程嚴格按其說明書操作。

紅細胞形態(tài)的觀察:取已制備好的紅細胞固定液，分別以50%、70%、80%、95%、100%酒精系列脫水（每級10min）;然后粘臺，干燥，E－1010離子濺射儀鍍膜，在HITACHI S－450掃描電子顯微鏡下觀察紅細胞形態(tài)和計算紅細胞畸形率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以ˉX±SD表示，對數(shù)據(jù)進行組間單因素方差分析及相關(guān)分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 四周游泳訓(xùn)練后各組小鼠紅細胞畸形率的比較及紅細胞掃描電鏡觀察

訓(xùn)練組小鼠紅細胞畸形率顯著高于安靜組（P＜0.01），表明4周游泳訓(xùn)練使機體氧化損傷加強，紅細胞受到自由基的損傷導(dǎo)致紅細胞形態(tài)發(fā)生改變，畸形紅細胞數(shù)增加，見圖1～圖6。訓(xùn)練+蜂膠組小鼠紅細胞畸形率顯著低于單純訓(xùn)練組（P＜0.01），提示蜂膠的抗氧化作用對紅細胞有保護作用，具體結(jié)果見表2。

2.2 四周游泳訓(xùn)練后各組小鼠血漿MDA含量、SOD活性、紅細胞Na+－K+－ATP酶活性

訓(xùn)練組小鼠血漿MDA含量顯著高于安靜組（P＜0.01）、SOD活性（P＜0.05）、Na+－K+－ATP酶活性（P＜0.05）顯著低于安靜組;訓(xùn)練+蜂膠組小鼠血漿MDA含量顯著低于單純訓(xùn)練組（P＜0.01）、SOD活性（P＜0.01）、Na+－K+－ATP酶活性（P＜0.05）顯著高于單純訓(xùn)練組。提示四周大強度游泳訓(xùn)練造成機體氧化損傷，而蜂膠有抗氧化損傷的作用。具體結(jié)果見表2。

2.3 各指標間的相關(guān)分析

紅細胞畸形率與MDA中度正相關(guān)（P＜0.01），與SOD中度負相關(guān)（P＜0.01），與Na+－K+－ATP酶低度負相關(guān)（P＜0.01）;Na+－K+－ATP酶活性與MDA低度負相關(guān)（P＜0.01），與SOD低度正相關(guān)（P＜0.01），見表3。

表2 4周游泳訓(xùn)練后小鼠各項指標的比較

表3 各指標間相關(guān)分析

2.4 蜂膠對運動訓(xùn)練小鼠心肌組織MDA含量、SOD、GSHPx、Ca2+－ATP酶活性的影響

表4結(jié)果顯示，經(jīng)4周遞增負荷游泳訓(xùn)練且最后一次力竭后，運動對照組MDA含量顯著高于安靜對照組（P＜0.01）;SOD、GSH－PX、Ca2+－ATP酶活性顯著下降，與安靜對照相比差異非常顯著（P＜0.01）。

與運動對照組小鼠同樣經(jīng)過相同的訓(xùn)練后，運動給藥組MDA含量顯著低于運動對照組（P＜0.01），SOD、GSH－Px、Ca2+－ATP酶活性顯著高于運動對照組（P＜0.05），且GSH－Px、Ca2+－ATP酶與運動對照組相比差異非常顯著（P＜0.01）。

表4 蜂膠對運動訓(xùn)練小鼠心肌MDA、SOD、GSH－Px、Ca2+－ATP酶的影響

3 分析與討論

3.1 大強度訓(xùn)練對小鼠紅細胞形態(tài)及自由基代謝的影響

本實驗中4周游泳訓(xùn)練后，小鼠血漿、心肌MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低。原因可能在于大負荷的訓(xùn)練使機體代謝加強，需氧量增加的同時產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并通過脂質(zhì)過氧化作用的鏈式反應(yīng)導(dǎo)致更多自由基的生成，造成生物膜的廣泛性損傷;同時脂質(zhì)過氧化物分解產(chǎn)物MDA大量增加，也對組織細胞造成損傷［1］。紅細胞是血液的主要有形成分，是血液運輸功能的主要執(zhí)行者。其強大的變形能力保證紅細胞能順利通過比自己直徑小的毛細血管。近年來的研究發(fā)現(xiàn)［2，3］大強度運動會導(dǎo)致紅細胞形態(tài)發(fā)生改變，畸形紅細胞比例升高。原因之一是運動源性自由基生成增多造成紅細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［4］。

本實驗中，經(jīng)過4周游泳訓(xùn)練后小鼠紅細胞畸形率顯著高于安靜組，且與血漿MDA含量正相關(guān)，與SOD活性和紅細胞Na+－K+－ATP酶活性負相關(guān)，證實自由基是造成紅細胞形態(tài)發(fā)生改變的原因之一。

3.2 蜂膠對大強度訓(xùn)練小鼠紅細胞形態(tài)及自由基代謝的影響

蜂膠（Propolis）是工蜂從植物的新生枝條、葉、芽或樹皮等組織上采集到樹脂狀分泌物后，混入其上鄂腺等腺體的分泌物和蜂蠟等加工而成的芳香膠狀物，具有廣泛的生理和藥理作用。蜂膠的化學(xué)成分極其復(fù)雜，目前已鑒定出300多種化合物，其中黃酮類化合物71種，可以說蜂膠是黃酮類化合物的寶庫，其品種和含量之豐富是植物藥不能相比的。

已有實驗證實蜂膠有抗氧化作用?？赡艿臋C制如下:①蜂膠可以提高機體抗氧化酶（如SOD、CAT）的活性，阻止自由基反應(yīng)的引發(fā)。②蜂膠可以阻斷自由基導(dǎo)致的鏈式反應(yīng)。蜂膠中起抗氧化作用的主要成分之一是黃酮類化合物，這類物質(zhì)以C6－C3－C6為基本骨架。黃酮化合物B環(huán)上3，4－鄰二羥基是具有清除自由基活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其他位上的羥基也起一定作用。黃酮類化合物通過酚羥基與自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，從而終止自由基鏈式反應(yīng)，這是黃酮類化合物清除自由基的最主要機制。③蜂膠中其他物質(zhì)的抗氧化活性。研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠中除黃酮有較強的抗氧化作用外，其它的成分也具有較好的抗氧化能力，如果糖、氨基酸、Ve、Se等。張燕平研究蜂膠對自由基的清除作用時發(fā)現(xiàn)，蜂膠分離純化后的收集液比粗提取物清除自由基效果減弱，說明蜂膠抗氧化性是各種組分協(xié)同作用的結(jié)果［5］。④也有人認為蜂膠抗氧化活性的發(fā)揮主要是通過螫合金屬離子而削弱金屬離子的促氧化作用。以上綜合作用的結(jié)果提高了機體的抗氧化能力，減弱了自由基對機體的氧化損傷。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，4周游泳訓(xùn)練后訓(xùn)練+蜂膠組小鼠紅細胞畸形率、血漿MDA含量顯著低于訓(xùn)練組小鼠，血漿SOD活性和紅細胞Na+－K+－ATP酶活性顯著高于訓(xùn)練組小鼠;且紅細胞畸形率與MDA呈正相關(guān)，與SOD活性和紅細胞Na+－K+－ATP酶活性呈負相關(guān)。提示蜂膠對紅細胞形態(tài)有保護作用，且與蜂膠的抗氧化作用有關(guān)。如前所述，蜂膠通過提高SOD活性增強機體的抗氧化能力、清除自由基，或阻斷自由基鏈式反應(yīng)，降低血漿MDA含量，減少紅細胞發(fā)生氧化損傷的機會;并且可以提高Na+－K+－ATP酶活性，穩(wěn)定紅細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，避免紅細胞發(fā)生腫脹或縮水變形。通過這些作用，紅細胞形態(tài)得到保護，畸形率顯著降低。

3.3 蜂膠對運動訓(xùn)練小鼠心肌SOD、GSH－PX活性的影響

本實驗結(jié)果顯示:運動至力竭后運動對照組小鼠心肌組織MDA的含量顯著升高，SOD、GSH－PX活性顯著降低，其機理可能是經(jīng)大負荷運動且最后做力竭運動后機體產(chǎn)生大量的自由基，超過了機體抗氧化系統(tǒng)清除能力，導(dǎo)致過剩自由基對細胞膜的攻擊加強，使細胞膜上酶的生物合成受到抑制并滅活其生物活性，SOD、GSH－PX活性下降。也可能是由于力竭運動后自由基大幅度增多，SOD被大量消耗，且SOD催化的OFR歧化反應(yīng)加強，H2O2生成增多，GSH－PX消耗也增加，使得SOD、GSH－PX含量下降。再者，力竭運動機體處于缺氧狀態(tài)，糖酵解加強，大量乳酸生成，且后期肌糖元排空，造成NADH及NADPH迅速下降，抑制了體內(nèi)自由基消除酶的活性（因為許多抗氧化酶都需要NADPH或NADH作為輔酶，才能充分發(fā)揮其活性），使自由基在體內(nèi)不斷增多，脂質(zhì)過氧化過程加劇［6］。

在本實驗中，蜂膠組小鼠SOD、GSH－PX活性均高于運動對照組，而MDA含量卻低于對照組。蜂膠具有較強的抗氧化性，除了上述幾點外，還可能與以下幾點有關(guān):①蜂膠中含有Cu、Zn、Se、Ge等多種微量元素，而這些微量元素已證明是有效的抗氧化劑或是構(gòu)成抗氧化成分所必需的物質(zhì)，可顯著提高機體內(nèi)SOD、GPX等的活性，增強了機體清除運動中生成的過量自由基的能力［7］;②蜂膠中含有維生素A原、維生素E、維生素C等，它們均為小分子的有機抗氧化劑［7］。

3.4 蜂膠對運動訓(xùn)練小鼠ATP酶活性的影響

本實驗中力竭運動后運動對照組小鼠心肌細胞Ca2+－ATP酶活性顯著下降。其原因可能在于一方面該酶活性受自身構(gòu)象和所處環(huán)境的影響，故活性的保持要求脂質(zhì)雙分子層中磷脂和膽固醇等的含量應(yīng)保持相對恒定，細胞膜必須保持適當?shù)牧鲃有?，而合適的膜流動性又有賴于充足的不飽和脂肪酸和抗氧化劑如GSH、維生素E［8］。力竭運動使得細胞膜磷脂雙分子層組分和流動性發(fā)生改變，影響了膜上的蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象和基團，繼而影響ATP酶活性;另一方面，是自由基對該酶的直接作用:自由基直接作用于酶上的活性基團－SH，引起膜蛋白巰基氧化交聯(lián)，導(dǎo)致酶活性的下降［9－11］;再者，力竭運動時心肌缺血，線粒體膜上腺嘌呤核苷酸移位酶被抑制，使胞漿ATP含量下降，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜中依賴ATP的Ca2+－ATP活性降低［12］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，力竭運動后蜂膠組小鼠心肌細胞Ca2+－ATP酶活性高于運動對照組，提示蜂膠對急性運動引起的心肌ATP酶的下降有調(diào)節(jié)作用。蜂膠對力竭運動小鼠心肌ATP酶的影響可能與其抗心肌缺血、抗氧化作用有關(guān):蜂膠通過提高SOD、GSH－PX活性增強組織細胞的抗氧化能力、清除自由基、降低細胞膜的脂質(zhì)過氧化水平，保護了細胞膜免受自由基損傷，也避免了由膜結(jié)構(gòu)損傷可能導(dǎo)致的Ca2+－ATP酶活性的降低（本實驗已證實），維持了心肌細胞ATP酶在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞等方面的正常發(fā)揮。

4 結(jié)論

1）經(jīng)過4周遞增負荷訓(xùn)練最后一次力竭，運動組小鼠呈疲勞狀態(tài)，心肌細胞自由基生成增多，抗氧化酶活性下降，致心肌發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷，心功能下降。

2）經(jīng)過4周游泳訓(xùn)練后，小鼠機體脂質(zhì)過氧化程度加重，運動能力下降。紅細胞在氧化損傷作用下，細胞形態(tài)發(fā)生改變，畸形率升高。

3）在4周的游泳訓(xùn)練過程中，給小鼠灌服蜂膠，可以明顯改善小鼠運動后紅細胞形態(tài)的畸形改變。提示蜂膠對小鼠的紅細胞形態(tài)的改善有保護作用。

4）蜂膠可通過提高抗氧化酶活性，改善運動力竭小鼠心肌相對缺氧狀態(tài)，減少自由基的生成而緩解心肌脂質(zhì)過氧化損傷和心功能降低，對心肌有一定的保護作用

5）蜂膠具有延緩疲勞發(fā)生、提高運動能力的作用。

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Effect of Proplis on the Delay of Fatigue in Training Rats

YU Yang1，HAN Xiaoyan2，PAN Yan3
（1.School of Human Exercise Science，Shenyang Sport University，Shenyang 110102，Liaoning，China;2.P.E.Department Yulin Normal University，Yulin 537000，Guangxi，China;3.College of Physical Education，Hubei Normal University，Huangshi 435002，Hubei，China）

According to the study，we can know the effect of proplis on the delay of fatigue in training rats.By setting up the model of gradual load training rats，the index of cardiac muscle and blood and the activity of SOD and Na+-K+-ATPase GSH-Px、Ca2+-ATPase and the quantity of MDA were measured.The result showed that rats which are in the proplis group，the index of SOD and Na+-K+-ATPase GSH-Px、Ca2+-ATPase in cardiac muscle and blood is much higher than the that of the training group（P ＜0.05）.Secondly，the activity of SOD and Na+-K+-ATPase 、GSH-Px、Ca2+-ATPase and remained at a higher level than the control group after training（P ＜0.05），then the activity of SOD in resting group have a significant divergence than control group（P ＜0.05）.After the rats took proplis，the quantity of MDA turned lower than that of the training group（P ＜0.05）.After the gradual load training，the quantity of MDA is higher than the resting training group（P＜0.05）.The result indicated that lipid per-oxidation increased in or after the gradual load training and proplis produce stronger influence on the anti-oxidation，anti-free-radical，raising exercise endurance and delaying fatigue in rats.

Proplis;training;delay of fatigne

G804.32

A

1004－0560（2012）02－0086－04

2011-09-17;

2011-11-09

于 洋（1961－），女，教授，學(xué)士，主要研究方向為運動疲勞恢復(fù)與營養(yǎng)。

責任編輯:郭長壽