正交設(shè)計優(yōu)選陳皮超臨界CO2萃取工藝

羅 歡，夏倫祝，韓燕全，左 冬，陳 楊

（1.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230038；2.安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑（三級）實驗室，安徽合肥 230031）

陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有健脾理氣、燥濕化痰的功效，為臨床常用中藥。研究表明陳皮脂溶性成分中含有的多甲氧基黃酮類成分對乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種癌細(xì)胞株具有較強(qiáng)的抑制作用［1］，其中以川陳皮素和橘皮素藥理活性較強(qiáng)且含量較高，由于他們較顯著的抗腫瘤作用而受到日益廣泛的關(guān)注［2］。目前關(guān)于陳皮提取研究的文獻(xiàn)并不多，尤其是對提取物化學(xué)成分等基礎(chǔ)研究更少，本實驗采用超高效液相色譜法（UPLC）對陳皮超臨界CO2萃取物中川陳皮素和橘皮素的含量進(jìn)行測定，采用L9（34）正交試驗探求陳皮的最佳超臨界CO2萃取工藝，為陳皮超臨界CO2萃取物的開發(fā)利用與質(zhì)量控制提供了參考。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

HL-5L/50MPa-CWQⅡ型超臨界CO2流體萃取設(shè)備（杭州市華黎泵業(yè)有限公司）；超高效液相色譜儀（Waters 公司Acquity UPLC 系統(tǒng)，包括四元高壓梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器以及Empower2 數(shù)據(jù)處理工作站）；AG285 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KQ3200DB 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

含量測定用對照品批號分別為：川陳皮素（20101225）、橘皮素（20110515）由鼎瑞化工（上海）有限公司生產(chǎn)，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS、IR 和UV等光譜鑒定其結(jié)構(gòu)，按本方法色譜條件，歸一化法測得它們的純度分別為98.30%、98.11%。陳皮藥材飲片由安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)鑒定為蕓香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）的干燥成熟果皮；CO2氣體（南京市氣體化工有限公司生產(chǎn)，純度≥99.5%）；甲醇（色譜純，美國Tedia 公司）；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 川陳皮素和橘皮素的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-水（45∶55）等度洗脫；流速：0.25 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；檢測波長：330 nm；洗脫程序：45%乙腈等度洗脫。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品川陳皮素、橘皮素適量，配成濃度分別為川陳皮素0.612 mg/mL、橘皮素0.436 mg/mL 的對照品儲備液。分別精密移取川陳皮素、橘皮素對照品儲備液1 mL 于10 mL 容量瓶中，甲醇定容至10 mL，臨用前用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取干燥的陳皮粉末9 份，每份300 g。精密稱取陳皮超臨界萃取物樣品（9 批）各50 mg 左右。定容至10 mL，超聲，離心，取上清液，臨用前用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系的考察 自動進(jìn)樣對照品溶液1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL、6 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得川陳皮素回歸方程為Y=832 629X-86 447（r=0.999 7），橘皮素回歸方程為Y=574 293X-38 872（r=0.999 9），表明川陳皮素和橘皮素分別在0.061 2 μg～0.367 2 μg，0.043 6 μg～0.261 6 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 取上述川陳皮素和橘皮素混合對照品溶液（濃度分別為0.061 2、0.043 6 mg/mL）自動重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積。川陳皮素、橘皮素峰面積的RSD（n=6）分別為0.46%和0.48%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（表3 正交試驗第三組），共6 份，按“2.1.3 項供試品溶液的制備”項下方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，川陳皮素和橘皮素峰面積的RSD（n=6）分別為0.11%、0.04%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。川陳皮素和橘皮素的OPLC 色譜圖見圖1。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0 h，1 h，2 h，3 h，4 h，8 h 進(jìn)樣分析，測得川陳皮素、橘皮素峰面積的RSD（n=6）分別為0.54%、0.82%。結(jié)果表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 UPLC 色譜圖

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知川陳皮素含量為15.247 mg/g，橘皮素含量為12.138 mg/g 的超臨界萃取物約0.02 g，精密加入一定量的川陳皮素、橘皮素對照品溶液，按“2.1.3 項供試品溶液的制備”項下方法操作，在“2.1.1 項色譜條件”項下進(jìn)樣，川陳皮素平均回收率為100.06%，RSD 為3.79%；橘皮素平均回收率為98.07%，RSD 為2.57%。結(jié)果見表1。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交實驗設(shè)計 對影響超臨界萃取的主要因素：萃取時間（A）、萃取溫度（B）、萃取壓力（C）、CO2流量（D）進(jìn)行L9（34）正交試驗，以萃取物得率和川陳皮素、橘皮素總含量為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳超臨界萃取工藝因素水平見表2，正交試驗結(jié)果見表3，超臨界萃取率及兩種成分總含量測定結(jié)果方差分析見表4，表5。由表4 可見，萃取時間、萃取溫度、CO2流速對超臨界萃取率有顯著影響，萃取壓力對萃取率無顯著影響。由表5 可見，4 個因素對萃取物中兩種成分的總含量均無顯著影響。綜合上述各種因素，確定超臨界CO2萃取陳皮的最佳萃取工藝條件為A2B2C1D2，即萃取時間2 h，溫度35 ℃，壓力30 MPa，流速20 Kg/h。

2.2.2 最佳萃取工藝條件的驗證 準(zhǔn)確稱取陳皮粉末3 份，每份300 g，按最佳萃取工藝條件平行操作，按“2.1.3 項供試品溶液的制備”項下方法制備成樣品溶液，自動進(jìn)樣測定，并計算樣品含量。結(jié)果表明，用最佳工藝條件萃取陳皮的萃取率為1.96%（RSD=0.32%，n=3），兩種成分平均含量為45.23 mg/g（RSD=0.54%，n=3）。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）

表2 因素水平表

表3 正交試驗結(jié)果

表4 超臨界萃取率測定結(jié)果方差分析

表5 兩種成分總含量測定結(jié)果方差分析

3 討論

超臨界CO2技術(shù)應(yīng)用于中藥提取是中藥現(xiàn)代研究的重要發(fā)展方向之一，該技術(shù)優(yōu)點在于以液態(tài)CO2作為萃取介質(zhì)，其提取物無需回收溶劑、無污染，同時具有提取溫度低、時間短、提取率高等優(yōu)點［3］。本文在文獻(xiàn)［4-5］報道的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計法對中藥陳皮超臨界萃取進(jìn)行了研究，實驗以萃取率和川陳皮素、橘皮素兩種有效成分的含量為指標(biāo)，對萃取過程中的4個主要影響因素即：萃取時間、萃取溫度、萃取壓力和CO2流速進(jìn)行了考察，得到的萃取工藝較為科學(xué)。

近年來隨著對陳皮研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)除了以橙皮苷為代表的黃酮苷類成分外，其所含的多甲氧基黃酮類成分也是陳皮中不可忽視的活性成分，這類成分具有特殊的抗腫瘤活性［6］，其中以川陳皮素和橘皮素的研究最多。從色譜圖中可見這兩種成分在陳皮超臨界CO2萃取物中含量較高，分離度好，可作為陳皮超臨界CO2萃取工藝和質(zhì)量控制的指標(biāo)。

實驗采用UPLC 法對陳皮超臨界CO2萃取物中川陳皮素、橘皮素的含量進(jìn)行了同時測定。由色譜圖可見，在4 min 內(nèi)即可完成一次進(jìn)樣，而傳統(tǒng)的HPLC 法一次進(jìn)樣需要近40 min［7］，可見UPLC 法對中藥多成分復(fù)雜體系的分析具有快速、高效的優(yōu)勢。川陳皮素和橘皮素色譜峰中間還存在另外一個含量較高的成分，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定其為3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮，但由于未能得到其對照品，本實驗未能對其含量進(jìn)行測定。

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