應(yīng)用雙球囊灌注導(dǎo)管局部注射紫杉醇對(duì)犬冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的預(yù)防作用

王錦達(dá)，楊庭樹(shù)，孫志軍，郭 軍，田 峰，陳韻岱

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科心臟介入中心，北京100853

冠狀動(dòng)脈植入支架與單純球囊擴(kuò)張相比，可顯著降低血管夾層、急性閉塞的發(fā)生率，但支架內(nèi)再狹窄問(wèn)題日益突出［1-2］。組織學(xué)研究顯示，與傳統(tǒng)的球囊成形術(shù)相比，支架植入更明顯地觸發(fā)了血管新生內(nèi)膜的增殖，且動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖過(guò)程顯著延長(zhǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示支架金屬絲對(duì)動(dòng)脈的損傷程度與新生內(nèi)膜厚度、支架內(nèi)狹窄程度之間顯著相關(guān)［3］。因此，支架內(nèi)再狹窄的主要機(jī)制是長(zhǎng)期過(guò)度的血管內(nèi)膜、平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)形成的結(jié)果［4］。藥物洗脫支架與金屬裸支架相比，可顯著降低再狹窄率，但隨著藥物洗脫支架的大量應(yīng)用，逐漸出現(xiàn)支架部位血管瘤樣擴(kuò)張、晚期血栓形成等致死性并發(fā)癥的報(bào)道［5-6］，分析其原因可能主要與支架上的多聚物涂層有關(guān)。

雙球囊灌注導(dǎo)管可以將紫杉醇直接灌注到靶病變部位，且紫杉醇為脂溶性藥物，具有高親脂性的特點(diǎn)，可以快速轉(zhuǎn)移到血管內(nèi)膜，達(dá)到抑制內(nèi)膜、平滑肌增殖，減輕支架內(nèi)再狹窄發(fā)生的效果，并且在冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)不留有任何藥物載體，避免了多聚物的不良反應(yīng)。本研究旨在利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，評(píng)價(jià)應(yīng)用雙球囊灌注導(dǎo)管在冠狀動(dòng)脈內(nèi)局部灌注紫杉醇預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的有效性和安全性。

材料和方法

主要試劑與儀器

紫杉醇:取0.1 ml的紫杉醇溶解于34.9 ml的生理鹽水中，制備成20 μmol/L的實(shí)驗(yàn)用藥。

雙球囊灌注導(dǎo)管:本研究使用的雙球囊灌注導(dǎo)管 (瑞士Acrostak公司)均為3.0 mm×20 mm，導(dǎo)管直徑為3F(圖1)。最遠(yuǎn)端的灌注部分包括2個(gè)阻塞球囊和球囊中間的灌注區(qū)域，灌注時(shí)，阻塞球囊直徑達(dá)到3 mm，灌注區(qū)域直徑為2 mm;遠(yuǎn)端球囊的內(nèi)側(cè)分布有3個(gè)側(cè)孔用來(lái)灌注藥物，此灌注部分通過(guò)中心腔和末端連接口連接于壓力泵;灌注球囊的工作壓為303 kPa。

動(dòng)物模型本研究在解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成，隨機(jī)選取15只雜種犬作為實(shí)驗(yàn)組，5只作為對(duì)照組。冠狀動(dòng)脈損傷模型的制作方法參照Schneider等［7］的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前12 h喂食阿司匹林和硫酸氫氯吡格雷，靜脈全身麻醉，給予心電監(jiān)護(hù)，穿刺右側(cè)股動(dòng)脈植入6F動(dòng)脈鞘，按照1 mg/kg的劑量動(dòng)脈內(nèi)注射普通肝素。調(diào)整指引導(dǎo)管進(jìn)入左主干開(kāi)口，行左冠狀動(dòng)脈造影顯示前降支和回旋支，選擇直徑為2.75～3.0 mm且無(wú)直徑大于1 mm分支的冠狀動(dòng)脈作為靶血管段，送入3.0～3.5 mm×8 mm的預(yù)擴(kuò)張球囊到達(dá)靶血管段，以1010～1616 kPa的壓強(qiáng)反復(fù)擴(kuò)張3～4次，每次持續(xù)15 s，每次間隔2 min。實(shí)驗(yàn)組用高壓注射器抽取配制好的20 μmol/L紫杉醇溶液10 ml，并連接于雙球囊灌注導(dǎo)管的末端，沿冠狀動(dòng)脈成形術(shù) (percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)導(dǎo)絲送入雙球囊灌注導(dǎo)管到達(dá)預(yù)損傷的靶血管段，確定損傷血管段完全被灌注球囊的灌注部分覆蓋，維持303 kPa灌注紫杉醇溶液，對(duì)照組抽取10 ml生理鹽水對(duì)靶血管進(jìn)行灌注，灌注時(shí)間為(26.45±5.18)s。最后沿導(dǎo)絲送入3.0 mm×8 mm的316L不銹鋼金屬裸支架 (LP-STENT，Boston Scientific)到達(dá)靶血管段，以808～1010 kPa的壓強(qiáng)釋放，支架膨脹良好。繼續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30 min，心率、血壓無(wú)異常，送回動(dòng)物飼養(yǎng)室觀察，每天喂食阿司匹林100 mg和硫酸氫氯吡格雷50 mg。

圖1 雙球囊灌注導(dǎo)管Fig 1 Double-balloon perfusion catheter

冠狀動(dòng)脈造影分析支架植入3個(gè)月后首先行冠狀動(dòng)脈造影復(fù)查，進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影計(jì)算機(jī)定量分析 (quantitative coronary angiography，QCA)，測(cè)量靶血管狹窄情況，觀察是否有瘤樣擴(kuò)張、血栓形成或血管閉塞等并發(fā)癥。冠狀動(dòng)脈造影復(fù)查靶血管直徑狹窄≥50%定義為再狹窄。

光學(xué)相干斷層成像分析冠狀動(dòng)脈造影復(fù)查后行光學(xué)相干斷層成像 (optical coherence tomography，OCT)檢查，OCT成像及分析應(yīng)用M2 OCT成像系統(tǒng)完成。應(yīng)用OCT系統(tǒng)內(nèi)的軟件進(jìn)行定量分析，測(cè)量工作由2名熟練技師完成，觀察所有支架金屬絲被內(nèi)膜覆蓋情況，選擇每枚支架內(nèi)直徑最小處管腔測(cè)量各項(xiàng)指標(biāo)，并測(cè)量此切面支架近端的距離，以便獲得同一切面的病理切片進(jìn)行分析。

組織學(xué)分析OCT檢查結(jié)束后處死動(dòng)物，快速取出心臟，用50 ml注射器抽取肝素鹽水反復(fù)沖洗左冠狀動(dòng)脈直至血液完全被沖洗干凈，保證血管內(nèi)無(wú)殘余血栓，用高壓注射器抽取10%福爾馬林溶液維持808 kPa灌注靶血管10 min，然后分離出靶血管段，用黑色細(xì)線標(biāo)記血管近端。標(biāo)本保存于10%福爾馬林溶液，最后統(tǒng)一行病理切片分析，常規(guī)脫水處理后用甲基丙烯酸甲酯進(jìn)行固定包埋，以專用的冠狀動(dòng)脈支架切片刀 (LEICA RM 2255，樂(lè)普醫(yī)療器械公司)進(jìn)行切片，每張切片厚度為7 μm，采用HE染色。根據(jù)OCT記錄支架內(nèi)直徑最小處距支架近端邊緣的距離，選取此位置行病理切片并在顯微鏡下測(cè)量各項(xiàng)指標(biāo)。

OCT和組織學(xué)檢查測(cè)量指標(biāo)(1)新生內(nèi)膜厚度 (mm):測(cè)量支架每個(gè)金屬絲到達(dá)血管內(nèi)膜的垂直距離，取其平均值。(2)殘余管腔面積 (mm2):血管腔的實(shí)際面積，邊界為血管內(nèi)膜。(3)新生內(nèi)膜面積 (mm2):以支架為外邊界，以內(nèi)膜為內(nèi)邊界，測(cè)量其間的總面積，即支架內(nèi)膜增生的面積。(4)支架面積 (mm2):以支架為邊界，測(cè)定所包含的面積。(5)外彈力膜面積 (mm2):以外彈力膜為邊界，測(cè)定所包含的面積。(6)狹窄程度 (%)=新生內(nèi)膜面積/支架面積 (%)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率或百分?jǐn)?shù)表示，采用卡方檢驗(yàn);以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均完成本研究，雙球囊灌注導(dǎo)管順利完成局部藥物注射。所有動(dòng)物心電圖均記錄到ST段壓低或抬高的情況，灌注結(jié)束后，ST段迅速恢復(fù)到灌注之前的形態(tài)，心率波動(dòng)在140～190次/min，未出現(xiàn)室速、室顫等惡性心律失常。隨訪過(guò)程中，1例動(dòng)物股動(dòng)脈穿刺處出現(xiàn)血腫，未影響本研究進(jìn)行。

冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果3個(gè)月后冠狀動(dòng)脈造影復(fù)查發(fā)現(xiàn)兩組均有部分支架段的影像學(xué)異常，QCA顯示實(shí)驗(yàn)組再狹窄發(fā)生率為33.33%，對(duì)照組為60%，對(duì)照組再狹窄發(fā)生率顯著高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。兩組的典型QCA分析圖見(jiàn)圖2。

OCT分析結(jié)果3個(gè)月后OCT檢查示兩組支架均完全內(nèi)皮化，無(wú)血栓、局部瘤樣擴(kuò)張，對(duì)照組支架內(nèi)膜增生程度明顯強(qiáng)于實(shí)驗(yàn)組 (表1，圖3)。

組織學(xué)檢查結(jié)果所有組織標(biāo)本取出后均未見(jiàn)血管內(nèi)有新鮮或者陳舊性血栓形成，行病理分析，所有標(biāo)本支架內(nèi)可見(jiàn)不同程度的內(nèi)膜增生，增生成分主要以內(nèi)膜增殖為主，平滑肌細(xì)胞增生及遷移不明顯。未見(jiàn)到血栓、瘤樣擴(kuò)張或血管壁細(xì)胞壞死，其中一張切片有脂肪滴侵入，為切片過(guò)程中所致。所有切片支架均完全內(nèi)皮化，支架金屬絲基本均勻分布于血管內(nèi)膜下，內(nèi)膜明顯增厚，血管腔變窄，部分標(biāo)本內(nèi)彈力纖維被支架金屬絲壓斷，部分標(biāo)本內(nèi)彈力纖維被擠壓變形但結(jié)構(gòu)完整，兩種情況平滑肌增生基本相似，未見(jiàn)平滑肌細(xì)胞嚴(yán)重增生的情況。所有標(biāo)本在新生內(nèi)膜和平滑肌細(xì)胞中均可見(jiàn)到輕度的炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞均勻散在分布于新生組織中，支架金屬絲周圍未出現(xiàn)炎癥細(xì)胞過(guò)度聚集的情況。對(duì)照組標(biāo)本血管內(nèi)膜增生出現(xiàn)不對(duì)稱、管腔狹窄較重且呈不規(guī)則狀的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組支架內(nèi)增生明顯較對(duì)照組輕 (圖4)，且增生基本均勻?qū)ΨQ。實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜增殖明顯弱于對(duì)照組 (表2)。

圖2 支架植入3個(gè)月后冠狀動(dòng)脈造影計(jì)算機(jī)定量分析圖Fig 2 Images of quantitative coronary angiography 3 months after stent implantation

表1 支架植入3個(gè)月后冠狀動(dòng)脈靶血管段OCT結(jié)果 (±s)Table 1 OCT parameters of target segment of coronary artery 3 months after stent implantation(±s)

表1 支架植入3個(gè)月后冠狀動(dòng)脈靶血管段OCT結(jié)果 (±s)Table 1 OCT parameters of target segment of coronary artery 3 months after stent implantation(±s)

OCT:光學(xué)相干斷層成像;由于OCT無(wú)法穿透支架金屬絲的遮擋，不能精確測(cè)量外彈力膜面積，故表中未顯示;與對(duì)照組比較，aP＜0.05OCT:optical coherence tomography;Area of extra elastic lamina is absent because OCT could not measure it precisely;aP＜0.05 compared with control group

組別Group新生內(nèi)膜厚度Neointimal thickness(mm)殘余管腔面積Lumen area(mm2)新生內(nèi)膜面積Neointimal area(mm2)支架面積Stent area(mm2)狹窄程度Extent of stenosis(%)對(duì)照組Control group 0.38±0.03 2.78±0.57 2.51±0.47 5.31±0.92 47.40±4.50實(shí)驗(yàn)組Treatment group 0.19±0.08a 3.50±0.66a 1.52±0.49a 5.01±0.79 30.13±8.56a

圖3 支架植入3個(gè)月后冠狀動(dòng)脈靶血管段OCT分析圖Fig 3 OCT images of target segment of coronary artery 3 months after stent implantatioin

圖4 支架植入3個(gè)月后冠狀動(dòng)脈靶血管段病理結(jié)果 (HE，×10)Fig 4 Pathological results of target segment of coronary artery 3 months after stent implantation(HE， ×10)

表2 支架植入3個(gè)月后冠狀動(dòng)脈靶血管段組織學(xué)檢查結(jié)果(±s)Table 2 Histologic parameters of target segment of coronary artery 3 months after stent implantation(±s)

表2 支架植入3個(gè)月后冠狀動(dòng)脈靶血管段組織學(xué)檢查結(jié)果(±s)Table 2 Histologic parameters of target segment of coronary artery 3 months after stent implantation(±s)

與對(duì)照組比較，aP＜0.05aP＜0.05 compared with control group

組別Group新生內(nèi)膜厚度Neointimal thickness(mm)殘余管腔面積Lumen area(mm2)新生內(nèi)膜面積Neointimal area(mm2)外彈力膜面積Extra elastic lamina area(mm2)支架面積Stent area(mm2)狹窄程度Extent of stenosis(%)對(duì)照組Control group 0.47±0.05 1.85±0.55 3.43±0.35 6.27±0.96 5.28±0.39 65.40± 8.23實(shí)驗(yàn)組Treatment group 0.22±0.10a 3.15±0.43a 1.85±0.78a 6.88±0.33 4.99±0.81 36.00±10.97a

討 論

本研究應(yīng)用雙球囊灌注導(dǎo)管在靶血管內(nèi)局部灌注紫杉醇，Herdeg等［8］的基礎(chǔ)研究顯示，通過(guò)這種雙球囊灌注導(dǎo)管可以有效地將紫杉醇轉(zhuǎn)運(yùn)到冠狀動(dòng)脈血管壁中，達(dá)到抑制內(nèi)膜和平滑肌增殖的有效濃度，而且其作用可以維持14 d。這種方法最大的安全隱患為阻斷血流，有可能導(dǎo)致嚴(yán)重心肌缺血、心律失常等并發(fā)癥，有研究表明，惡性心律失常高發(fā)于阻斷冠狀動(dòng)脈血流5～20 min時(shí)。本研究中采用的灌注時(shí)間平均為 (26.45±5.18)s，并且在此時(shí)間內(nèi)，紫杉醇能夠有效轉(zhuǎn)移到血管壁中發(fā)揮作用，在球囊阻斷血流的過(guò)程中盡管出現(xiàn)心電圖ST段變化，但是未發(fā)生惡性心律失常、死亡等嚴(yán)重并發(fā)癥，提示本研究采用的方法是安全的。

紫杉醇通過(guò)促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制解聚，保持微管蛋白穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞有絲分裂，從而抑制細(xì)胞增殖［9］。本研究就是利用了紫杉醇抑制冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜及平滑肌增殖的作用。關(guān)于紫杉醇的毒副作用，目前報(bào)道的有白細(xì)胞減少、外周神經(jīng)毒性等，也有無(wú)癥狀、一過(guò)性心動(dòng)過(guò)緩的報(bào)道，這些都是在針對(duì)惡性腫瘤患者的大劑量化療時(shí)表現(xiàn)出來(lái)的，其藥物濃度為本研究的100～1000倍，而且都是長(zhǎng)時(shí)間給藥。本研究使用的紫杉醇濃度和劑量極低，用藥后在外周血中幾乎測(cè)不到紫杉醇的濃度，所以基本不會(huì)產(chǎn)生毒副作用。在術(shù)后3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，所有動(dòng)物均存活，經(jīng)相關(guān)檢查未發(fā)現(xiàn)血栓、血管正性重構(gòu)、支架內(nèi)皮化不全等并發(fā)癥，也說(shuō)明這種方法的安全性。

目前評(píng)價(jià)支架有效性的方法包括冠狀動(dòng)脈造影再狹窄率以及近年來(lái)應(yīng)用的OCT評(píng)價(jià)方法，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括支架內(nèi)膜覆蓋的程度和厚度等［10-11］。本研究中術(shù)后3個(gè)月時(shí)冠狀動(dòng)脈造影發(fā)現(xiàn)對(duì)照組再狹窄率明顯高于實(shí)驗(yàn)組，OCT和病理檢查也均發(fā)現(xiàn)對(duì)照組內(nèi)膜增生厚度、面積、狹窄程度均顯著高于實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果提示應(yīng)用雙球囊灌注導(dǎo)管局部注射紫杉醇可以顯著降低裸支架再狹窄的發(fā)生率。

本研究給藥方法的一大優(yōu)點(diǎn)是藥物可以充分均勻地作用到整個(gè)靶血管壁，有別于藥物洗脫支架將藥物攜帶于金屬絲表面，對(duì)血管壁的藥物作用是支架的印記效應(yīng)。本研究在OCT和病理分析中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組支架表面的內(nèi)膜增生厚度和對(duì)照組相比，較為均一。但本研究未設(shè)置藥物洗脫支架組并與其進(jìn)行對(duì)比，這是本研究的不足之處。

OCT可以在活體上精確評(píng)價(jià)支架植入后的內(nèi)膜覆蓋程度和厚度，所以O(shè)CT正逐漸被用來(lái)評(píng)價(jià)支架植入安全性和有效性，本研究中應(yīng)用OCT也驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)組處理方法的有效性，其測(cè)量結(jié)果與病理學(xué)方法相一致。應(yīng)用OCT評(píng)價(jià)支架術(shù)后內(nèi)膜增生情況是該研究的一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)。

總之，本研究結(jié)果顯示:應(yīng)用雙球囊灌注導(dǎo)管在靶血管內(nèi)局部灌注紫杉醇，可以安全、有效地降低裸支架內(nèi)內(nèi)膜增殖，獲得較大的管腔面積。

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