類風濕關節(jié)炎患者外周血單個核細胞Sonic Hedgehog信號通路表達的初步研究*

王明霞， 黃建林△， 朱尚玲， 彭蔚湘， 謝寶釗， 林灼鋒， 古潔若

(1中山大學附屬第三醫(yī)院風濕科，廣東 廣州 510630；2溫州醫(yī)學院藥學院，浙江 溫州 325035 )

1000-4718(2012)03-0483-05

2011-09-21

2011-11-02

國家自然科學基金資助項目(No.81072480)；廣東省自然科學基金資助項目(No.10151008901000210)

△通訊作者 黃建林 Tel:020-85252194;E-mail:jianlin_h@163.com；林灼鋒 E-mail:lzfwh@126.com

類風濕關節(jié)炎患者外周血單個核細胞Sonic Hedgehog信號通路表達的初步研究*

王明霞1， 黃建林1△， 朱尚玲1， 彭蔚湘1， 謝寶釗1， 林灼鋒2△， 古潔若1

(1中山大學附屬第三醫(yī)院風濕科，廣東 廣州 510630；2溫州醫(yī)學院藥學院，浙江 溫州 325035 )

目的初步探討類風濕關節(jié)炎(RA)患者外周血單個核細胞(PBMCs)和滑膜組織中Sonic Hedgehog(Shh)信號通路相關因子表達及意義。方法收集符合1987年美國風濕病學會(ACR)RA分類標準、28個關節(jié)疾病活動度評分(DAS28)≥3.2，病情活動RA患者(35例)及年齡、性別相匹配的健康志愿者(35例)外周血2 mL，分離PBMCs，提取總RNA，采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測Shh信號通路中信號肽Shh、膜受體Ptch1和核轉錄因子Gli1 mRNA的表達。收集10例病情中度活動(DAS28≥3.2)RA患者的滑膜組織，同時收集5例外傷或半月板損傷(無關節(jié)炎)者滑膜組織作為對照組，免疫組化檢測Shh、Ptch1和Gli1的蛋白表達情況。結果RA患者PBMCs中Shh和Gli1 mRNA的相對表達量分別為1.36±1.48和1.15±0.68，對照組上述信號分子的mRNA表達量分別為0.47±0.25和0.49±0.05，2組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Ptch1 mRNA表達在2組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；免疫組化示Shh和Gli1蛋白表達的陽性細胞百分率均高于對照組(P<0.05)，Ptch1蛋白表達陽性細胞百分率2組無顯著差異(P>0.05)。結論RA患者PBMCs與滑膜組織中檢測到Shh通路相關信號分子Shh和Gli1的表達上調，提示RA患者中可能存在Shh信號通路的激活，其在RA發(fā)病機制中的作用值得進一步研究。

關節(jié)炎，類風濕； Sonic Hedgehog通路； 單核細胞; 滑膜

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種好發(fā)于青壯年、以對稱性多關節(jié)炎為主要表現的異質性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1]。迄今為止，RA的發(fā)病機制未能完全闡明，治療方面也缺乏特別有效的方法。有研究表明成纖維樣滑膜細胞過度增殖以及滑膜血管新生是RA滑膜炎和關節(jié)破壞的最主要原因[2]。在腫瘤中Sonic Hedgehog(Shh)信號通路與腫瘤血管生成密切相關[3]。Shh信號通路主要由3部分組成：Hedgehog(Hh)配體Shh、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)，跨膜受體Patched(Ptch)和Smoothened(Smo)及核轉錄因子腦膠質細胞瘤相關原癌基因家族glioma-associated oncogene-1(Gli1)、glioma-associated oncogene-2(Gli2)和glioma-associated oncogene-3(Gli3)[4-5]。其中Hh是啟動因子；Ptch是效應細胞膜表面受體；Gli是轉錄效應器。當缺乏Hh時，Ptch與Smo結合并抑制Smo的活性，Gli復合物以非全長的形式發(fā)揮轉錄抑制功能；當Hh存在時，則Hh與Ptch結合，解除了Ptch對Smo的抑制作用，激活下游的Gli轉錄因子，以全長形式轉入核內引起靶基因的轉錄[6]。

Jorgensen等[7]曾推測Hedgehog 基因家族可能參與RA的發(fā)病，但是具體機制未進一步闡明。本研究采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)法檢測了病情活動的RA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中Shh信號通路中信號肽Shh、膜受體Ptch1和核轉錄因子Gli1 mRNA表達，并用免疫組化方法檢測了RA滑膜中上述信號分子的蛋白表達情況。

材 料 和 方 法

1材料

人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物，Trizol購自Invitrogen。無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷購自廣州東征公司。明膠購自Sigma，DNA marker購自北京天根生物。PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Tap Kit購自TaKaRa。免疫組化試劑：Ⅰ抗Shh(mouse IgG)抗體購自Sigma,Gil1(rabbit IgG)和Ptch1(goat IgG)抗體購自Santa Cruz；Ⅱ抗購自Dako。

2研究對象

收集2010年1月～2011年6月在我院門診和住院的符合1987年美國風濕病學會(ACR)RA分類標準的病情中度活動(DAS28評分均≥3.2)的RA患者共35例，其中女性28例，男性7例，年齡26～66歲，中位年齡48歲。以健康志愿者(35名)作為對照組，其中女性27例，男性8例，年齡25～67歲，中位年齡46歲。2組年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。獲得病人及志愿者的知情同意后抽靜脈血2 mL，采用肝素抗凝。

收集10例我院關節(jié)外科住院且病情中度活動(DAS28≥3.2)需行關節(jié)置換手術RA患者的滑膜組織，同時收集5例外傷或半月板損傷(無關節(jié)炎)者滑膜組織作為對照。滑膜組織用4 %多聚甲醛固定，石蠟包埋。

3方法

3.1Real-time PCR檢測信號分子的表達 肝素抗凝靜脈血2 mL，常規(guī)密度梯度離心法分離PBMCs，Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計檢測標本濃度及純度，要求A260/280在1.8～2.0，按TaKaRa兩步法試劑盒提供的說明書進行逆轉錄及定量PCR操作。Real-time PCR檢測Shh、Ptch1和Gli1mRNA的表達。引物序列如下：(1)GAPDH正義鏈5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,反義鏈5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；(2)Shh：正義鏈5’-TCCAGAAACTCCGAGCGATTTAAG-3’，反義鏈5’- CACTCCTGGCCACTGGTTCA-3’；(3)Ptch1,正義鏈5’-CTGCGTCAGCAGAGTGATTC-3’,反義鏈5’-AGCTGAGGGTGTCCTGTGTC -3’,(4)Gli1正義鏈5’-AGGGAGTGCAGCCAATACAG-3’，反義鏈5’-CCGGAGTTGATGTAGCTGGT -3’。PCR反應條件：95 ℃ 30 s ，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，循環(huán)40次。融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s， 95 ℃ 15 s。反應在ABI 7000定量熒光PCR儀上進行，每一輪反應均設置復孔及陰性對照。應用比較Ct法進行相對定量，目標基因的相對定量用2-ΔΔCt來計算。反應結束后取每對樣品的PCR產物8 μL，行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳(120V、20 min)，凝膠成像系統(tǒng)拍攝進行驗證。

3.2免疫組織化學檢測 石蠟包埋的組織經脫蠟，0.3% H2O210 min 阻斷內源性過氧化酶活性。微波爐抗原熱修復處理。10%正常山羊血清室溫濕盒封閉30 min。滴加Ⅰ抗4 ℃過夜，PBS洗5 min，3次。Ⅱ抗室溫濕盒40 min。DAB顯色后，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。每項實驗都有陰性對照(缺少Ⅰ抗)，胞內、胞膜或胞核出現棕黃色顆粒為陽性表達。每張玻片在400倍高倍鏡下觀察5個視野，計數陽性細胞數和總細胞數，計算陽性細胞表達率。陽性表達率(%)= 陽性細胞數/總細胞數×100%。評判標準如下：未見陽性細胞者為陰性(-)；< 25%為弱陽性(+)； 25% ～ 75%為中度陽性(++)；> 75%為強陽性(+++)。

4統(tǒng)計學處理

結 果

1Real-timePCR檢測Shh信號分子Shh、Ptch1和Gli1mRNA在PBMCs中的表達

從表1中可見，與對照組相比，RA組的Shh mRNA和Gli1 mRNA的表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而Ptch1 mRNA的表達量2組之間無明顯差異(P>0.05)。同時對PCR產物進行了瓊脂糖凝膠電泳，以驗證目的基因的圖譜，見圖1，結果與real-time PCR產物大小相符。

2RA滑膜組織免疫組織化學結果

圖2可見Shh蛋白在滑膜組織以胞膜及胞質均可見表達，以胞膜為主，見圖2A。Ptch1蛋白在滑膜組織以胞膜表達為主，見圖2C。Gli1蛋白在滑膜組織以胞核表達為主，見圖2E。

Figure 1. The PCR results for Shh, Ptch1 and Gli1.Lane 1, 6: marker; Lane 2, 7: Shh; Lane 4, 9: Ptch1; Lane 5, 10: Gli1; Lane 3, 8: GAPDH.

圖1PCR產物凝膠電泳圖

表1Shh、Ptch1和Gli1mRNA在PBMCs中的表達結果

GroupShhPtch1Gli1RA1.36±1.48*1.22±0.691.15±0.68*Control0.47±0.251.18±0.850.49±0.05

*P<0.05vscontrol.

Figure 2. The immunohistochemical staining of synovial tissues from RA and control groups (DAB, ×400). A, C, E and G: RA group; B, D, F and H: control group; A, B: Shh; C, D: Ptch1; E, F: Gli1; G, H: negative control.

圖2類風濕關節(jié)炎和對照組滑膜組織的免疫組化結果

表2為類風濕關節(jié)炎組和對照組滑膜組織Shh、Ptch1和Gli1蛋白表達的半定量分析。RA組Shh和Gli1蛋白中度陽性表達率分別為80%(8/10)和20%(2/10)，明顯高于對照組的40%(2/5)和0(0/5)，P<0.05。Ptch1蛋白中度陽性表達RA組為4/10、對照組為2/5，比率均為40%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；3種蛋白均未見強陽性表達。RA組表達Shh和Gli1蛋白的陽性百分率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雖然RA組Ptch1蛋白表達陽性率較對照組稍高，但差異無統(tǒng)計

學意義(P>0.05)。

討 論

Shh信號通路是一個進化保守的信號家族，首先在果蠅中發(fā)現[8-9]，隨后又在脊椎動物中被證實。正常情況下Shh信號通路調控著胚胎期組織細胞的生長分化，胚胎發(fā)育成熟后，進入失活狀態(tài)。近來研究發(fā)現在人類多種腫瘤中Shh信號通路存在異常激活[10-17]，而Shh通路激活后其下游血管內皮生長因子(VEGF)合成增加[18]，促進腫瘤血管的增生。RA基本病理改變?yōu)殛P節(jié)滑膜慢性炎癥，形成侵襲性血管翳，后者可破壞軟骨、骨與周圍組織。

表2 RA及對照組Shh、Ptch1和Gli1蛋白的表達半定量分析

*P<0.05vscontrol.

目前認為，Shh信號通路主要由Hh配體、2個膜受體Ptch和Smo及下游的轉錄因子Gli組成[19]。本研究采用實時熒光定量PCR方法檢測Shh通路中的信號肽Shh，膜受體Ptch1和核轉錄因子Gli1 mRNA的表達情況。結果發(fā)現RA組外周血PBMCs的Shh與Gli1 mRNA的表達量明顯高于對照組，而Ptch1 mRNA的表達與對照組相比無明顯差異。提示Shh信號通路在活動性RA患者的PBMCs中存在基因轉錄增多激活。RA患者PBMCs細胞中是否有蛋白水平的翻譯表達尚需進一步驗證。

本研究采用免疫組化的方法從蛋白角度檢測了Shh通路中的信號肽Shh，膜受體Ptch1和核轉錄因子Gli1在滑膜組織的表達情況。結果發(fā)現Shh和Ptch1蛋白在滑膜組織以細胞膜表達為主。Gli1蛋白在滑膜組織中以細胞核表達為主，其蛋白表達位置與腫瘤組織相似[20-21]。此外，本研究還顯示RA滑膜組織中Shh和Gli1蛋白中度陽性表達率均高于對照組，進一步提示Shh信號通路在RA滑膜組織可能存在異常激活。

Hedgehog信號通路激活有幾種表現：配體依存性和非配體依存性。本研究發(fā)現RA患者中配體Shh的表達在基因與蛋白水平都較正常對照組升高，提示該通路為配體依存性激活。配體表達水平改變而導致通路的激活可能是Sonic Hedgehog信號通路在RA的主要作用機制。

有研究[22-23]發(fā)現，Shh通路參與器官的急慢性損傷，在慢性肺損傷與急性腦損傷時均可引起此通路的激活。對照組5例滑膜組織亦可見蛋白的弱陽性表達，可能是由于對照組雖無明顯關節(jié)炎，但是急慢性炎癥損傷可能激活機體相應的保護機制，從而導致此通路的部分表達。

總之，本實驗通過real-time PCR和免疫組化方法從基因和蛋白水平對RA患者PBMCs和滑膜組織中Shh信號通路相關分子進行了檢測，初步證明了RA患者中可能存在Shh信號通路的激活。其在RA發(fā)病機制中所扮演的角色值得進一步研究。

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PreliminarystudyofSonicHedgehogsignalingpathwayinrheumatoidarthritis

WANG Ming-xia1, HUANG Jian-lin1, ZHU Shang-ling1, PENG Wei-xiang1, XIE Bao-zhao1, LIN Zhuo-feng2, GU Jie-ruo1

(1DepartmentofRheumatology,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2PharmacySchool,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035,China.E-mail:jianlin_h@163.com;zflwh@126.com)

AIM: To investigate the expression of Sonic Hedgehog (Shh) signaling pathway-associated factors in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and synovial tissues of rheumatoid arthritis (RA).METHODSThe mRNA expression levels of Shh, Ptch1 and Gli1 in PBMCs of 35 RA patients, and 35 age-and sex-matched healthy controls were analyzed by real-time PCR. The expression of Shh, Ptch1 and Gli1 in synovial tissues was detected by immunohistochemisty assay in 10 RA patients and 5 patients with traumatic or meniscal injury (no arthritis) as control group. All patients accorded with the American College of Rheumatology (ACR) 1987 revised classification criteria for determining RA, and the score of DAS28 was ≥3.2.RESULTSThe results of real-time PCR showed that the expression of Shh and Gli1 mRNA in RA patients was higher than that in the controls (Shh and Gli1 in RA were 1.36±1.48 and 1.15±0.68, while Shh and Gli1 in control group were 0.47±0.25 and 0.49±0.05, respectively). The mRNA expression of Ptch1 between the 2 groups had no significant difference. Similarly, the results of immunohistochemistry assay showed that the positive staining rates of Shh and Gli1 in RA group were higher than those in control group. However, no difference of Ptch1 positive staining rate between the 2 groups was observed (P>0.05).CONCLUSIONThe positive expression of Shh and Gli1 indicates the activation of Shh signaling pathway in the RA patients.

Arthritis, rheumatoid; Sonic Hedgehog pathway; Monocytes; Synovial membrane

R593

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.017