腺病毒介導(dǎo)的shRNA下調(diào)PTEN表達(dá)對體外活化肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

郭 劍， 劉小娟， 張國尊， 孫慧聰， 劉林力， 郭金波， 劉 蕾， 姚冬梅， 宋 梅， 張曉嵐△

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 1消化內(nèi)科，2心臟外科，河北 石家莊 050000)

1000-4718(2012)09-1627-06

2012-03-11

2012-07-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30872513);河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.C2010000565);河北省科技廳課題平臺處項(xiàng)目(No.09966108D)

△通訊作者 Tel: 0311-66002955; E-mail: xiaolanzh@126.com

腺病毒介導(dǎo)的shRNA下調(diào)PTEN表達(dá)對體外活化肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

郭 劍1， 劉小娟1， 張國尊1， 孫慧聰1， 劉林力2， 郭金波1， 劉 蕾1， 姚冬梅1， 宋 梅1， 張曉嵐1△

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院1消化內(nèi)科，2心臟外科，河北 石家莊 050000)

目的探討腺病毒介導(dǎo)的shRNA下調(diào)第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)表達(dá)對體外培養(yǎng)的大鼠活化肝星狀細(xì)胞(HSCs)增殖和凋亡的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法體外培養(yǎng)活化HSCs，以腺病毒為載體將靶向PTEN的shRNA干擾重組體轉(zhuǎn)染至體外活化的大鼠HSCs；四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測HSCs增殖；末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)及流式細(xì)胞術(shù)測定HSCs凋亡；Western blotting方法檢測PTEN、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)情況；實(shí)時熒光定量PCR方法檢測PTEN、Akt及ERK1 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果(1) 靶向PTEN的RNA干擾重組腺病毒成功感染體外活化HSCs，并在一定范圍內(nèi)呈時間依賴性地促進(jìn)HSCs增殖，腺病毒感染HSCs后72 h，HSCs凋亡率顯著下降(P<0.05)；(2) Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增加(P<0.05)；(3) p-Akt和p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；而Akt蛋白及其mRNA、ERK1蛋白及其mRNA表達(dá)均無顯著改變(P>0.05)。結(jié)論RNA干擾下調(diào)PTEN基因表達(dá)可能通過Bcl-2/Bax途徑促進(jìn)體外活化HSCs增殖并抑制其凋亡，此外，RNA干擾下調(diào)PTEN基因表達(dá)促進(jìn)p-Akt和p-ERK1/2表達(dá)增多，提示PTEN可能通過影響PI3K/Akt和ERK1/2信號通路而在調(diào)控HSCs增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。

肝星狀細(xì)胞； 第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因； RNA干擾； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化在肝纖維化過程中發(fā)揮著重要作用[1]。如何抑制HSCs活化、增殖并誘導(dǎo)其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵所在。HSCs在增殖、活化過程中受到多種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，作用于這些信號通路或者其中級聯(lián)反應(yīng)的重要環(huán)節(jié)已成為目前防治肝纖維化的新思路。

第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[2]，其蛋白產(chǎn)物具有脂質(zhì)磷酸酶與蛋白磷酸酶雙重活性，可以負(fù)性調(diào)控磷脂酰肌醇-3激酶 (phosphoinositol- 3-kinase, PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B(serine-threonine protein kinase B, Akt)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)化。已有研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的PTEN可顯著抑制體外活化HSCs的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[3- 4]，但PTEN的低表達(dá)對體外活化HSCs增殖、凋亡的影響及其細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍需進(jìn)一步明確。為此，本研究通過構(gòu)建HSCs的PTEN低表達(dá)模型，觀察下調(diào)PTEN表達(dá)對活化HSCs增殖及凋亡的影響，從而為尋求治療肝纖維化的有效新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1試劑與細(xì)胞系

攜帶靶向PTEN的短發(fā)卡狀RNA并表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的腺病毒(PTEN shRNA)及表達(dá)EGFP的空病毒(Ad-EGFP)由武漢市晶賽生物工程技術(shù)有限公司協(xié)助構(gòu)建；小鼠抗PTEN單克隆抗體、小鼠抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、山羊抗Akt多克隆抗體、兔抗p-Akt多克隆抗體、兔抗ERK1/2多克隆抗體和兔抗p-ERK1/2多克隆抗體均購于Santa Cruz；SYBR Green Real Master Mix購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠肝星狀細(xì)胞系HSCs-T6(其表型為活化的HSCs)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京腫瘤研究所；AD293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室長期冷凍保存。

2實(shí)驗(yàn)分組

(1)對照組，僅以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染步驟加入無血清無抗生素DMEM代替病毒液；(2)Ad-EGFP組，轉(zhuǎn)染表達(dá)EGFP的空病毒Ad-EGFP；(3)PTEN shRNA組，轉(zhuǎn)染靶向PTEN的RNA干擾重組腺病毒PTEN shRNA。

3腺病毒感染HSCs

以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)50進(jìn)行腺病毒感染。確定所需病毒顆粒量(細(xì)胞數(shù)×MOI)，用無血清無抗生素的DMEM稀釋病毒液并加入細(xì)胞生長的培養(yǎng)器皿，使病毒液均勻分布。置于37 ℃孵箱中孵育2 h，每隔15 min輕輕傾斜轉(zhuǎn)動培養(yǎng)器皿，促進(jìn)感染；2 h后，補(bǔ)加適當(dāng)體積完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育到實(shí)驗(yàn)所需時間，通過倒置熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上。

4直接細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制HSCs生長曲線

取對數(shù)生長期的HSCs，胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×108L-1，每孔1 mL，加入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)箱中孵育至70%～80%細(xì)胞融合時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)6復(fù)孔，于0 h、24 h、48 h和72 h分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。

5MTT法測定HSCs增殖

將呈指數(shù)生長的HSCs以每孔6×103個細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積200 μL，按上述方法進(jìn)行腺病毒感染，每組6個復(fù)孔，另設(shè)陰性對照孔。分別于腺病毒感染后24 h、48 h和72 h每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，加入二甲基亞砜150 μL，酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度(absorbance,A)，以無細(xì)胞培養(yǎng)液孔調(diào)零。細(xì)胞生長增殖率(%)=[實(shí)驗(yàn)組A值-對照組A值]/對照組A值×100%。

6TUNEL法檢測HSCs凋亡

腺病毒感染HSCs后72 h，收集各組細(xì)胞爬片，應(yīng)用TUNEL法按說明書操作檢測HSCs凋亡，凋亡HSCs細(xì)胞核為棕黃色。隨機(jī)選取5個高倍視野觀察，計(jì)算凋亡指數(shù)。

7流式細(xì)胞術(shù)檢測HSCs凋亡率

腺病毒感染HSCs后72 h，收集各組細(xì)胞，70%冰乙醇固定過夜，經(jīng)碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液處理后，流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率。

8Westernblotting檢測活化HSCs中PTEN、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)

腺病毒感染HSCs后72 h，提取各組細(xì)胞蛋白，考馬斯亮藍(lán)比色法測定蛋白含量。應(yīng)用Western印跡技術(shù)檢測HSCs的PTEN、Bax、Bcl-2、ERK1/2、p-ERK1/2、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)，小鼠抗PTEN單克隆抗體、小鼠抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、山羊抗Akt多克隆抗體、兔抗p-Akt多克隆抗體、兔抗ERK1/2多克隆抗體、兔抗p-ERK1/2多克隆抗體及兔抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體均為1∶200稀釋，采用NIH ImageJ 1.38軟件進(jìn)行定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果以目的條帶和內(nèi)參照的吸光度值來表示。

9實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測HSCs中PTEN、Akt和ERK1mRNA表達(dá)

腺病毒感染HSCs后72 h，按Trizol試劑盒說明提取各組細(xì)胞總RNA，電泳鑒定RNA并定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；PTEN、Akt、ERK1及內(nèi)參照GAPDH引物參照GenBank基因序列自行設(shè)計(jì)，由北京賽百盛基因有限公司合成。PTEN:上游引物5′- GGA AAG GAC GGA CTG GTG TA -3′，下游引物5′- TGC CAC TGG TCT GTA ATC CA -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為101 bp；GAPDH：上游引物5′- GGC AAG TTC AAC GGC ACA G -3′，下游引物5′- CGC CAG TAG ACT CCA CGA CAT -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為122 bp；Akt：上游引物5′- GAG GAG CGG GAA GAG TG -3′，下游引物5′- GAG ACA GGT GGA AGA AGA GC -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為672 bp；ERK1:上游引物5′-TCA TAG GCA TCC GAG ACA TC-3′，下游引物5′-TGG TAG AGG AAG TAG CAG ATG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為148 bp。在ABI Prism 7700實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時定量擴(kuò)增。SYBR反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)條件95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，35個循環(huán)。采用相對定量2-ΔΔCt法比較目的基因mRNA的表達(dá)差異。

10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1PTENshRNA抑制體外活化HSCs中PTEN的表達(dá)

腺病毒感染HSCs后72 h，應(yīng)用實(shí)時定量RT-PCR檢測PTEN mRNA的表達(dá)。以對照組PTEN基因的表達(dá)量為1，則Ad-EGFP組、PTEN shRNA組較對照組的PTEN mRNA的相對倍數(shù)分別為0.93倍和0.63倍，PTEN shRNA組PTEN mRNA表達(dá)明顯低于對照組及Ad-EGFP組(P<0.05)。Western blotting檢測PTEN蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)，PTEN shRNA組(1.11±0.03)顯著低于對照組(1.49±0.04)及Ad-EGFP組(1.48±0.02)(P<0.05)，見圖1。表明shRNA可顯著抑制體外培養(yǎng)的活化HSCs中PTEN的表達(dá)。

Figure 1. Western blotting analysis was used to detect PTEN，Bax， Bcl-2，Akt，p-Akt，ERK1，ERK2，p-ERK1 and p-ERK2 protein expression in HSCs in different groups.

圖1Westernblotting檢測各組HSCs中PTEN、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達(dá)

2PTENshRNA促進(jìn)活化的HSCs增殖

在一定時間范圍內(nèi)，PTEN shRNA可呈時間依賴性地促進(jìn)HSCs生長，增殖率于72 h達(dá)最高，較對照組升高22.5%；MTT檢測結(jié)果顯示，腺病毒感染活化HSCs后24 h，Ad-EGFP及PTEN shRNA對細(xì)胞增殖均無明顯作用(P>0.05)。但在48 h、72 h時PTEN shRNA可顯著刺激HSCs增殖，其增殖率分別為29.51%、43.29% (相對于對照組) (P<0.01)，見圖2、表1。

圖2直接細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制的不同時點(diǎn)HSCs的生長曲線

表1 HSCs MTT結(jié)果

**P<0.01vscontrol and Ad-EGFP.

3PTENshRNA抑制活化的HSCs凋亡

TUNEL法檢測結(jié)果顯示，腺病毒感染HSCs后72 h，PTEN shRNA組HSCs凋亡率為2.94%±0.31%，低于對照組(5.17%±0.27%)及Ad-EGFP組(5.34%±0.43%)(P<0.05)。PI標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，PTEN shRNA組HSCs凋亡率(1.26%±0.18%)低于對照組(3.28%±0.42%)及Ad-EGFP組(2.95%±0.41%) (P<0.05)，這表明PTEN shRNA可抑制活化的HSCs凋亡，見圖3、4。

4PTENshRNA對活化HSCsBax及Bcl-2表達(dá)的影響

Western blotting檢測腺病毒感染HSCs 72 h Bax蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，PTEN shRNA組(0.98±0.04)顯著低于對照組(1.29±0.03)及Ad-EGFP組(1.30±0.04)(P<0.05)；而對Bcl-2蛋白的檢測結(jié)果顯示，PTEN shRNA組(1.86±0.06)較對照組(1.48±0.04)及Ad-EGFP組(1.47±0.05)顯著升高(P<0.05)，對照組與Ad-EGFP組之間無顯著差異(P>0.05)，見圖1。

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測腺病毒感染肝星狀細(xì)胞72h的凋亡率

圖4TUNEL法檢測腺病毒感染肝星狀細(xì)胞72h的凋亡率

5PTENshRNA對HSCsAkt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白及AktmRNA和ERK1mRNA表達(dá)的影響

腺病毒感染HSCs 72 h，Western blotting檢測各組HSCs的Akt和ERK1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，Akt蛋白表達(dá)在對照組(1.05±0.02)、Ad-EGFP組(0.99±0.05)與PTEN shRNA組(1.03±0.02)間均無顯著差異(P>0.05)；ERK1蛋白表達(dá)在對照組(1.11±0.03)、Ad-EGFP組(1.15±0.04)及PTEN shRNA組(1.13±0.04)之間亦無顯著差異(P>0.05)；檢測HSCs中p-Akt蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，PTEN shRNA組(1.59±0.03)顯著高于對照組(1.21±0.03)及Ad-EGFP組(1.16±0.04) (P<0.05)。p-ERK1蛋白表達(dá)顯示，PTEN shRNA組(1.20±0.02)顯著高于對照組(0.73±0.05)和Ad-EGFP組(0.81±0.04) (P<0.05)，見圖1。實(shí)時熒光定量PCR檢測HSCs中Akt及ERK1 mRNA表達(dá)，以對照組Akt及ERK1 mRNA的表達(dá)量為1，則Ad-EGFP組和PTEN shRNA組相對對照組的Akt mRNA表達(dá)倍數(shù)分別為0.94倍和1.05倍，Ad-EGFP組和PTEN shRNA組相對對照組的ERK1 mRNA表達(dá)倍數(shù)分別為0.99倍和1.04倍，表明兩者在各組間均無顯著差異(P>0.05)。

討 論

PTEN蛋白是一種具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性的特異性磷酸酶，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)PTEN與腎纖維化[5]、肺纖維化、心肌纖維化[6]、肝纖維化[7]等多種纖維化疾病相關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了靶向PTEN的RNA干擾重組體，研究抑制PTEN表達(dá)后對HSCs細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

Hettinger等[8]的研究結(jié)果表明，當(dāng)抑制腫瘤細(xì)胞中PTEN表達(dá)時，可使腫瘤細(xì)胞的生存率提高，凋亡率減少。本實(shí)驗(yàn)在重組腺病毒成功感染HSCs的基礎(chǔ)上，應(yīng)用直接細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長曲線和MTT法測定了HSCs的增殖情況。其結(jié)果顯示，PTEN shRNA可在一定范圍內(nèi)呈時間依賴性地促進(jìn)HSCs增殖，與Hettinger等[8]的研究結(jié)果一致。

在肝損傷修復(fù)過程中，往往伴隨著活化HSCs數(shù)量的減少，而細(xì)胞凋亡則是其主要機(jī)制[9]，本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HSCs凋亡，其結(jié)果顯示：PTEN shRNA組凋亡率較對照組和Ad-EGFP組明顯降低(P<0.05)。此外采用TUNEL法也顯示：PTEN shRNA組HSCs凋亡率明顯低于對照組及Ad-EGFP組(P<0.05)。這2種方法均表明下調(diào)PTEN表達(dá)后HSCs凋亡受到抑制。細(xì)胞凋亡受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控，其中Bcl-2家族是最重要因子之一，Bcl-2具有抑制凋亡作用，而Bax是Bcl-2的顯性抑制因子，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。本研究觀察到，PTEN shRNA成功轉(zhuǎn)染HSCs后，Bcl-2表達(dá)明顯升高，Bax表達(dá)降低，Bcl-2/Bax比值升高，從而表明在下調(diào)PTEN表達(dá)后，HSCs凋亡受到抑制，生存期延長，這提示Bcl-2/Bax升高可能是低表達(dá)的PTEN誘導(dǎo)活化HSCs增殖的機(jī)制之一。

磷酸化和去磷酸化在細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)放大系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，而PTEN蛋白在酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要作用。有研究表明PI3K/Akt和ERK1/2信號通路參與了活化HSCs增殖、凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控[11-12]。PTEN蛋白的脂質(zhì)磷酸酶可以負(fù)性調(diào)控PI3K/Akt信號通路所介導(dǎo)的細(xì)胞生長，若PTEN失活，PI3K/Akt將持續(xù)活化，可導(dǎo)致細(xì)胞體積增大、分裂加速、凋亡阻滯[13]。而PTEN蛋白的蛋白磷酸酶活性可抑制ERK1/2上游的銜接蛋白Shc的磷酸化和Ras的活化，從而負(fù)性調(diào)控ERK1/2信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞周期[14]。本研究進(jìn)一步研究了下調(diào)PTEN表達(dá)后HSCs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)情況，其結(jié)果顯示，采用腺病毒介導(dǎo)的PTEN shRNA下調(diào)PTEN的表達(dá)后，活化HSCs的Akt、ERK1蛋白及其mRNA表達(dá)均無明顯變化，但p-Akt和p-ERK1/2蛋白表達(dá)卻明顯增高，提示下調(diào)PTEN的表達(dá)后，脂質(zhì)底物PIP3的去磷酸化可能受到了抑制，從而使HSCs的p-Akt表達(dá)明顯升高，PI3K/Akt信號通路得以發(fā)揮其所介導(dǎo)的細(xì)胞生長作用，以及下調(diào)PTEN表達(dá)后可使HSCs中ERK1/2的磷酸化水平增加，這些均表明PTEN表達(dá)降低可能通過影響PI3K/Akt和ERK1/2信號通路而參與了對活化HSCs增殖和凋亡的調(diào)控。

本研究初步證實(shí)，下調(diào)PTEN表達(dá)后可激活活化HSCs中PI3K/Akt及ERK1/2信號通路，進(jìn)而導(dǎo)致HSCs增殖加快及凋亡減少，這與我們的前期研究以及國外學(xué)者Takashima等[15]的研究結(jié)果相一致。已有研究表明，活化的Akt可以通過使Bcl-2家族成員之一的BAD的Ser136位點(diǎn)磷酸化,從而使Bcl-2表達(dá)增多而發(fā)揮抗凋亡作用[16]，同時也能磷酸化Bax的Ser184位點(diǎn)使 Bax表達(dá)減少而抑制細(xì)胞凋亡[17]。由此可見，低表達(dá)的PTEN可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路中Akt的磷酸化水平進(jìn)而調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax途徑來發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡的作用。然而，調(diào)控活化HSCs增殖和凋亡的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有多種，各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間彼此影響、相互作用，PI3K/Akt及ERK1/2信號通路僅可能是PTEN調(diào)控HSCs生理過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一。PTEN是否還通過其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制來參與對HSCs增殖及凋亡的調(diào)節(jié)，還需要進(jìn)一步的研究和探討。

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Effectsofadenovirus-mediatedshRNAtargetingPTENonproliferationandapoptosisofactivatedhepaticstellatecellsinvitro

GUO Jian1, LIU Xiao-juan1, ZHANG Guo-zun1, SUN Hui-cong1, LIU Lin-li2, GUO Jin-bo1, LIU Lei1, YAO Dong-mei1, SONG Mei1, ZHANG Xiao-lan1

(1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofCardiacSurgery,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China.E-mail:xiaolanzh@126.com)

AIM: To investigate the down-regulation of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 (PTEN) gene by adenovirus-mediated short hairpin RNA (shRNA) on proliferation and apoptosis of activated hepatic stellate cells (HSCs)invitroand the related signaling transduction pathways.METHODSThe activated HSCs were culturedinvitroand transfected with recombinant adenovirus expressing shRNA targetingPTEN. The proliferation of HSCs was measured by MTT assay and the apoptosis was assessed by TUNEL and flow cytometry. Western blotting was used to detect the protein levels of PTEN, Bax, Bcl-2, Akt, p-Akt, ERK1/2 and p-ERK1/2 in HSCs, and real-time fluorescent quantitative PCR was applied to detect the mRNA expression of Akt and ERK1.RESULTSThe recombinant adenovirus expressing shRNA targetingPTENwas successfully transfected into activated HSCsinvitro, and significantly promoted the proliferation of HSCs in a time-dependent manner within a certain extent. The apoptotic rate of HSCs was significantly decreased 72 h after transfection (P<0.05). Meanwhile, reduced expression of Bax and elevated expression of Bcl-2 were induced 72 h after transfection (P<0.05). Furthermore, the expression of p-Akt and p-ERK1/2 were increased significantly (P<0.05), while no significant difference in the expression of Akt and ERK1 at mRNA and protein levels was observed (P>0.05).CONCLUSIONDown-regulation ofPTENby adenovirus-mediated shRNA dramatically promotes the proliferation of activated HSCs, and inhibits the apoptosis through Bcl-2/Bax pathway. In addition, the phosphorylation of Akt and ERK1/2 is increased, indicating that PI3K/Akt and ERK1/2 signal transduction pathways may play an important role in the regulation of proliferation and apoptosis of HSCs.

Hepatic stellate cells; Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10; RNA interference; Cell proliferation; Apoptosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.016