湘油15 PGIP 9蛋白基因的克隆和蛋白序列結(jié)構(gòu)分析及原核表達

，，，*

(1湖南農(nóng)業(yè)大學油料作物研究所，長沙 410128； 2 國家油料作物改良中心湖南分中心, 湖南長沙 410128)

2011-09-14

劉睿洋(1986—)，男，河南平頂山人，碩士研究生，Email:ruiyang_liu2007@126.com。*通信作者，Email:guancy2011@yahoo.com.cn。

國家“863”基金項目(2006AA10A112);農(nóng)業(yè)部“948”基金項目(2011-G23)。

湘油15 PGIP 9蛋白基因的克隆和蛋白序列結(jié)構(gòu)分析及原核表達

劉睿洋1，皇甫海燕2，靳芙蓉2，官春云2*

(1湖南農(nóng)業(yè)大學油料作物研究所，長沙 410128； 2 國家油料作物改良中心湖南分中心, 湖南長沙 410128)

運用生物信息學軟件對湘油15PGIP9基因的核苷酸、蛋白氨基酸序列進行分析，并對其蛋白結(jié)構(gòu)進行預測。結(jié)果表明：湘油15PGIP9編碼區(qū)CDS長1 011 bp，編碼336個氨基酸的開放閱讀框，分子量為37.5 kDa，等電點為7.9。N端1～22個氨基酸是信號肽，且這一區(qū)域疏水性較強，具有5個潛在的N-糖基化位點。N端和C端還各具有4個參與二硫鍵形成的半胱氨酸殘基。二級結(jié)構(gòu)顯示有11個α-螺旋，14個β-延伸和25個無規(guī)則卷曲。中心LRR結(jié)構(gòu)域由6個串聯(lián)的LRR基序組成。隨后將PGIP9的CDS序列亞克隆到原核表達載體pET-32a(+)中，構(gòu)建pET-32a-PGIP9重組表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E.coilBL21(DE3)，25℃，終濃度為0.2 mmol/L和0.5 mmol/L的 IPTG誘導2 h，都成功的表達了融合蛋白pET-32a-PGIP9，其分子量約為52 kDa，發(fā)現(xiàn)主要以包涵體形式存在，沒有可溶形式的蛋白表達。

甘藍型油菜；多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白；原核表達；序列分析；結(jié)構(gòu)預測

油菜菌核病嚴重的影響到了油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]，而內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶(edo-polygalacturonases，PGs)是植物致病的主要因素[2,3]。相關(guān)研究[4,5]表明,植物體內(nèi)會產(chǎn)生一種特異性的熱穩(wěn)定糖蛋白——多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting proteins，PGIPs)來抵御PGs對自身的侵害。近些年來，國內(nèi)外學者[6～9]對植物PGIP基因進行了廣泛深入的研究，證明PGIPs主要通過亮氨酸重復結(jié)構(gòu)域(Leucine-reach repeat，LRR)來發(fā)揮其抑制PGs的作用。筆者克隆了抗菌核病油菜湘油15的PGIP9 CDS序列，并運用生物信息學軟件進行分析，隨后將其構(gòu)入原核表達載體，進行體外表達，旨在對PGIP9基因抗菌核病機理進行探索。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍型油菜湘油15號和油菜菌核均由國家油料改良中心湖南分中心提供。Pfu DNA聚合酶、A-Tailing 試劑盒、T4-DNA連接酶、Taq DNA 聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 片段純化/回收試劑盒、BL21(DE3)感受態(tài)細胞、低分子量標準蛋白(14.4 ～94.0 kDa)、2×蛋白上樣緩沖液均購自北京天根生化科技公司。Plant Total RNA 提取試劑盒購自安比奧公司；限制性內(nèi)切酶和cDNA Synthesis試劑盒購自Fermentas公司；大腸桿菌TOP10、pMD-18T購自TaKaRa公司。BugBuster Master Mix預混蛋白抽提試劑盒；2異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、其它化學藥品均為分析純。原核表達載體pET-32a(+)由湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院分子與免疫學實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌核菌菌絲的培養(yǎng)和油菜葉片的接種

根據(jù)油菜接種菌核菌后誘導了其體內(nèi)的PGIP含量增加，接種湘油15油菜葉片。菌核菌菌絲的培養(yǎng)和油菜葉片的接種參照文獻[10]的方法。接種好的油菜，放于培養(yǎng)箱溫度25℃，濕度90%，培養(yǎng)18 h后剪取接種葉片無病斑的部分，用于提取總RNA。

1.2.2 湘油15 PGIP 9基因的克隆

RNA的提取按照安比奧RNA提取試劑盒步驟，第一鏈cDNA的合成按照Fermentas RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit步驟。參考NCBI公布油菜(Brassicanapus)PGIP9基因序列(GenBank登錄號EU142030)，并根據(jù)其CDS序列設(shè)計一對特異引物，并在上、下游引物兩端分別引入BamHI和SalI酶切位點。

上游引物PF: 5’ GGATCCATGGATCATAAGACAAACAC3’，下游引物PR:5’ GTCGACTTACTTGCAACTACTATCAA3’

以上引物由Invitrogen生物公司合成。以第一鏈cDNA為模板，PCR擴增目的基因。程序：94℃預變性3 min，94℃變性50 s，57℃退火50 s，72℃延伸2 min，共27個循環(huán)；最后72℃保溫5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切目的條帶用膠回收試劑盒回收?；厥债a(chǎn)物與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTOP10感受態(tài)細胞，PCR鑒定陽性克隆，送去Invitrogen生物公司測序。

1.2.3 湘油15 PGIP9序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預測

以DNAMAN軟件分析PGIP9 CDS序列、氨基酸序列，預測其分子量。以DNAStar軟件分析了等電點、親水性與疏水性、各種酸、堿性氨基酸、疏水性氨基酸、親水性氨基酸的組成以及各氨基酸在PGIP9蛋白的比例。SignalP 3.0Server預測PGIP9蛋白的N端信號肽。NetNGlyc 1.0 Server預測N-糖基化位點。ProtScale預測蛋白質(zhì)的疏水性和親水性以及PGIP9蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 pET-32a-PGIP9重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在E.coli BL21(DE3)中的誘導表達

BamHI和SalI，分別雙酶切PGIP9和pET-32a(+)質(zhì)粒，膠回收目的片段，經(jīng)T4-DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21(DE3)，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA后，進行酶切鑒定。挑取單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基(70 g/mLAmp+), 37℃搖床震蕩過夜培養(yǎng)活化。次日取活化的培養(yǎng)物按1∶100比例接種到LB液體培養(yǎng)基(70 g/mLAmp+)，37℃，300 rpm震蕩培養(yǎng)，待OD600值約為0.6時，加IPTG終濃度至0.2 mmol/L和0.5 mmol/L，25 ℃誘導2 h，收集1 mL菌液，12 000 rpm 離心10 min，棄上清液，收集菌體沉淀。將沉淀用BugBuster Master Mix預混蛋白抽提試劑，破碎大腸桿菌細胞壁(按照BugBuster Master Mix Kit步驟)，抽提后沉淀和上清各加入等體積的2×蛋白loading buffer，沸水浴5 min，冰浴2 min，5%的濃縮膠和12%的分離膠，SDS-PAGE可溶性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 湘油15 PGIP 9 CDS的克隆

由圖1、圖2可以看出， RT-PCR擴增得到了一條大小約為1 100 bp的片段。經(jīng)測序分析，其堿基序列與NCBI庫上公布的甘藍型油菜PGIP9 CDS序列同源性為97.23%。

圖1 湘油15總RNA的提取

圖2 湘油15 PGIP9 CDS序列RT-PCR擴增

2.2 湘油15 PGIP9蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 PGIP9氨基酸序列分析

運用DNAStar軟件對湘油15 PGIP9蛋白氨基酸序列進行分析，該序列包含一個編碼336個氨基酸的開放閱讀框，其理論分子量為37.5 kDa，等電點為7.9。pH為7.0時，電荷為3.30，堿性氨基酸(KR)26個，占總分子量的9.72%，占殘基總數(shù)的7.74%；酸性氨基酸(DE)24個，占總分子量的7.67%，占氨基酸殘基總數(shù)的7.14%；疏水氨基酸(AILFWV)115個，占總分子量的35.53%，占氨基酸殘基總數(shù)34.23%；極性氨基酸(NCQSTY)117個，占總分子量的33.76%，占氨基酸殘基總數(shù)的34.82%。其中亮氨酸的個數(shù)是50，所占的比例最高，占總分子量的15.10%，占氨基酸殘基總數(shù)14.88%。

由圖3可以看出， 1～22個氨基酸是信號肽，信號肽裂解點位于第22和23個氨基酸之間。蛋白質(zhì)序列中的信號肽有助于蛋白本身向細胞內(nèi)特定區(qū)域移動，表明與蛋白質(zhì)的定位有關(guān)。預測得到湘油15 PGIP9蛋白質(zhì)氨基酸序列具有5個潛在的N-糖基化位點，分別位于第6，111，135，243，296位氨基酸處，結(jié)構(gòu)為N-X-T/S。N端和C端還各具有4個參與二硫鍵形成的半胱氨酸殘基。

圖3 湘油15 PGIP9 CDS序列及氨基酸序列方框內(nèi)為起始密碼子ATG和終止密碼子TAA;下劃線為信號肽序列;淺色陰影部分為N-糖基化位點;深色心型陰影為半胱氨酸殘基。

2.2.2 湘油15 PGIP9二級結(jié)構(gòu)LRR基序和三級結(jié)構(gòu)預測

由圖4、圖5可以看出，湘油15 PGIP9蛋白有11個α-螺旋，14個β-延伸鏈，25個無規(guī)則卷曲，蛋白質(zhì)凹面結(jié)構(gòu)主要由β-折疊/β-轉(zhuǎn)角區(qū)構(gòu)成，凸面結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋，中心LRR結(jié)構(gòu)域由6個串聯(lián)的LRR基序組成，是由β折疊和α螺旋通過loop環(huán)連接形成的一個馬蹄型分子結(jié)構(gòu)。從第125個氨基酸出現(xiàn)且具有“xLxxLxLxxNxLxGxIPxxLxxL”序列的共同序列。其LRR除個別替換、插人或缺失外，序列高度保守。

圖4 湘油15 PGIP9二級結(jié)構(gòu)LRR基序

圖5 湘油15 PGIP9三維結(jié)構(gòu)預測

圖6 重組表達質(zhì)粒pET-32a-PGIP9雙酶切鑒定

2.3 pET-32a-PGIP9重組質(zhì)粒的構(gòu)建

由圖6可見，雙酶切所得片段與目的基因大小一致，證明PGIP9基因已正確插入到了pET-32a(+)原核表達載體上。

2.4 pET-32a-PGIP9重組蛋白在E.coli BL21(DE3)中的誘導表達及可溶性分析

由圖7可以看出，pET-32a-PGIP9重組質(zhì)粒在25℃、IPTG終濃度分別為0.2，0.5 mmol/L誘導2 h后，破菌裂解的沉淀中在預期位置(箭頭所指處約52 kDa)附近出現(xiàn)了誘導條帶(泳道4和泳道6)。裂解的上清液中在預期位置沒有誘導蛋白條帶的出現(xiàn)(泳道3和泳道5)。未誘導的和陰性對照則都沒有相應(yīng)的蛋白條帶出現(xiàn)(泳道1和泳道2)。結(jié)果表明pET-32a-PGIP9重組質(zhì)粒在大腸桿菌中能夠成功表達，融合蛋白主要以不溶的包涵體形式存在，沒有可溶形式的蛋白表達。

圖7 pET-32a-PGIP9重組蛋白誘導表達電泳圖泳道1：25℃，pET-32a(+)空載體誘導2 h；泳道2：pET-32a-PGIP9未誘導；泳道3：25℃，0.2 mmol/L IPTG，pET-32a-PGIP9誘導2 h破菌上清；泳道4：25℃，0.2 mmol/L IPTG，pET-32a-PGIP9誘導2 h破菌沉淀；泳道5：25℃，0.5 mmol/L IPTG，pET-32a-PGIP9誘導2 h破菌上清；泳道6：25℃，0.5 mmol/L IPTG，pET-32a-PGIP9誘導2 h破菌沉淀

3 結(jié)論與討論

前人研究[11～15]表明，PGIPs屬于高等植物LRR蛋白家族，具有典型的重復LRR基序結(jié)構(gòu)[11]，LRR結(jié)構(gòu)由β-折疊/β-轉(zhuǎn)角/β-折疊/α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域構(gòu)成，被認為是參與蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵區(qū)域[12]，PGIPs正是通過LRR基序暴露于外表面的氨基酸殘基來抑制PGs的活性[13]，PGIPs—PGs相互作用已成為在分子水平上研究植物富含亮氨酸的重復單位介導的特異識別的一種模式系統(tǒng)[14，15]。本試驗對湘油15 PGIP9蛋白序列進行預測分析：該蛋白具有 6個LRR重復序列，從第125個氨基酸開始具有“xLxxLxLxxNxLxGxIPxxLxxL”這樣的保守序列；在N端和C端各有4個Cys殘基，相鄰的兩個Cys殘基經(jīng)氧化反應(yīng)形成1個-S-S-，對于維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生物活性具有重要作用[16]。同時對湘油15 PGIP9進行了原核大腸桿菌體外表達，誘導所得蛋白條帶與預期的融合蛋白大小一致。試驗結(jié)果顯示，在溫度25℃，IPTG濃度0.2 mmol/L，時間2 h內(nèi)，pET-32a-PGIP9重組質(zhì)粒雖然在E.coilBL21(DE3)中能夠穩(wěn)定高效表達，但還是主要以包涵體形式存在，沒有可溶形式的蛋白表達。包涵體雖然沒有生物活性，但可有效防止細胞內(nèi)蛋白酶的水解作用，使目的蛋白大量聚集，并有利于表達量的提高，也便于蛋白的分離純化[17]。PGIP9蛋白主要以不溶的包涵體表達，可能是蛋白本身的結(jié)構(gòu)所致，其疏水氨基酸所占比例較高。但對于湘油15 PGIP9蛋白抗菌核病機理研究，還需進一步試驗探討。

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Cloning,SequenceandStructureAnalysisofPolygalacturonaseInhibitingProteinGene(PGIP9)ofBrassicanapusXiangyou15andProkaryoticExpression

(1 Oilseed Crops Institute，Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China；2 National Center of Oil Seed Crops Improvement, Hunan Branch, Changsha, Hunan 410128, China)

Ribonucleotide and amino acid sequence of Xiangyou 15PGIPwere analyzed, the protein structure were predicted by biological information software. CDS of Xiangyou 15PGIP9 code area was 1 011 bp, which encoded 336 amino acid of open reading frame with a molecular mass of 37.5 kDa and isoelectric point of 7.9. 1～22 amino acids were predicted to the N-terminal signal peptide with stronger hydrophobic region. The deduced amino acids sequence contained 5 potential N-glycosylation sites and 4 cysteine residues on N-terminal and C-terminal respectively, which involved in constituting the disulfide linkages. Secondary structure displayed it contained 11 α-helices,14 β-extension and 25 random coils. The center LRR structural domain was composed of 6 tandem LRRs motifs. Later, CDS ofPGIP9 was subencoded into the prokaryotic expression vector pET-32a(+)constructing recombinant expression plasmid pET-32a-PGIP9 and was transformed intoEscherichiacoliBL21(DE3).The fusion protein pET-32a-PGIP9 was successfully expressed under final concentration 0.2 mmol/L and 0.5 mmol/L IPTG at 25℃ inducing for 2 h. The molecular weight of fusion protein was 52 kDa, it mainly appeared as inclusion bodies, not appeared as soluble protein.

Brassicanapus; PGIP9; Prokaryotic expression; Sequence analysis; Structure prediction

Q78

A

1001-5280(2012)02-0134-05

10.3969/j.issn.1001-5280.2012.02.07

責任編輯：劉目前