6-BA對黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)影響的初步研究

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(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，湖南長沙 410128)

6-BA對黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)影響的初步研究

吳蓮蓉，徐慶國*，李洪，武羿君，黃萍，張婷，趙鑫，李斌，高偉

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，湖南長沙 410128)

為了確立最佳的黑麥草再生體系，選用多年生黑麥草雅晴、沃土和一年生黑麥草特高等3個不同黑麥草品種的成熟種子為外植體，分別采用CC，MS，NB，N6等4種基本培養(yǎng)基，在每種培養(yǎng)基中分別加入5 mg/L的2,4-D和0，0.05，0.1，0.2和0.4 mg/L等5種濃度的6-BA進行愈傷組織誘導(dǎo)。結(jié)果表明：在6-BA濃度為0.05 mg/L時，黑麥草各品種愈傷組織的誘導(dǎo)率最高；在相同濃度6-BA作用下，不同黑麥草品種間愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著的品種間差異；不同基本培養(yǎng)基對黑麥草愈傷組織的誘導(dǎo)率也存在影響，4種供試基本培養(yǎng)基中，以CC基本培養(yǎng)基的黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)率最高。

黑麥草；愈傷組織；6-BA

黑麥草(Lolium L.)屬禾本科黑麥草屬植物,原產(chǎn)于歐洲西南部、北非及亞洲西南部，栽培歷史悠久?，F(xiàn)已成為世界溫帶地區(qū)最重要的禾本科牧草[1]，具有生長快、分蘗多、耐牧、綠色期長和葉片光滑柔軟、色澤美麗等優(yōu)點[2]。在我國長江以北的溫帶地區(qū)，黑麥草是最重要的草種之一,對人工草地建植十分重要,是很有潛力的種質(zhì)資源[3，4],在長江以南的亞熱帶和熱帶地區(qū)也經(jīng)常與其它草種混播,廣泛應(yīng)用于公共綠地、家庭庭院、運動場和高爾夫球場的建設(shè)[3～7]。但因其越夏難、高溫高濕條件下易發(fā)生病害、高溫環(huán)境下需水量大等問題,限制了其在城市綠地和牧草種植中的應(yīng)用。國內(nèi)外多年來一直致力于通過組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對黑麥草進行遺傳改良[8～10],并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，但是還沒有轉(zhuǎn)基因抗高溫節(jié)水型黑麥草品種應(yīng)用于草業(yè)生產(chǎn)。對黑麥草進行遺傳轉(zhuǎn)化,第一步要建立其愈傷組織再生體系，而作為建立高頻再生體系的前提和基礎(chǔ),愈傷組織的誘導(dǎo)非常關(guān)鍵[17，18]，高質(zhì)量的愈傷組織是進一步誘導(dǎo)分化和生根的前提和基礎(chǔ)[19]。

目前國內(nèi)研究普遍認(rèn)為以黑麥草成熟種子為外植體，在所用的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入2，4-D(濃度為5 mg/L)誘導(dǎo)效果最佳,但誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中是否有必要加入分裂素(例如6-芐氨基嘌呤，6-BA)還不確定[11]。徐定炎等[12]通過實驗表明，以6-BA濃度為0 mg/L時，黑麥草成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)率最高；李雪等[13]通過實驗認(rèn)為，6-BA濃度對黑麥草成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)率影響不顯著；杜雪玲等[14]通過實驗表明，在2,4-D為5 mg/L,6-BA為0.05 mg/L時,黑麥草各品種愈傷組織的質(zhì)量和誘導(dǎo)率最高；陳季琴等[15]通過實驗認(rèn)為，2,4-D濃度在5 mg/L,6-BA濃度在0.025 mg/L或0.2 mg/L有利于黑麥草成熟種子誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；楊茹等[16]通過實驗認(rèn)為，6-BA濃度為0.1 mg/L時有利于多年生黑麥草成熟種子誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。因此，草坪草組織培養(yǎng)條件和植株再生頻率的影響因素依然是一個亟待研究的重要課題[20]。本研究選取不同黑麥草成熟種子為外植體，研究不同濃度6-BA對黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)的影響，并試圖找到能產(chǎn)生高出愈率的黑麥草基因型(品種)、6-BA最佳濃度和最佳基本培養(yǎng)基，為黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)，還有可能篩選耐高溫節(jié)水型黑麥草無性變異系，為我國草業(yè)生產(chǎn)和黑麥草育種提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗選用北京百綠(天津)國際草業(yè)有限公司提供的多年生黑麥草雅晴、沃土和一年生黑麥草特高等3個黑麥草品種的成熟種子作為外植體材料。

1.2 外植體消毒方法

先將3個黑麥草品種的種子用無菌水浸泡2 h，然后用70%酒精處理30 s,無菌水沖洗3次，再用升汞處理15 min，無菌水沖洗6次。經(jīng)過處理的種子即可用于接種。

1.3 培養(yǎng)基

采用MS，N6，CC和NB等4種基本培養(yǎng)基，分別加5 mg/L的2，4-D，再分別加0，0.05，0.1，0.2和0.4 mg/L等5種濃度的6-BA，共設(shè)置了16種不同的培養(yǎng)基組合。調(diào)節(jié)各培養(yǎng)基的pH至5.8。

1.4 愈傷組織誘導(dǎo)

將經(jīng)過消毒處理的3個黑麥草品種的種子接種到不同培養(yǎng)基組合,每個培養(yǎng)皿接種30粒種子,每個培養(yǎng)基組合設(shè)置3次重復(fù),置于25～26℃、暗培養(yǎng)條件下進行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.5 愈傷組織觀察及記錄

不同品種的黑麥草種子消毒后，分別接種于誘導(dǎo)愈傷組織的不同培養(yǎng)基組合中，接種7 d后開始統(tǒng)計種子的發(fā)芽率和出愈率，每隔5 d統(tǒng)計1次，記錄數(shù)據(jù)。按如下公式和標(biāo)準(zhǔn)記錄各處理的發(fā)芽率和出愈率：

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/接種數(shù)×100

為解決加濕器啟停帶來的溫濕度慣性，加濕器保持預(yù)熱狀態(tài)。當(dāng)室內(nèi)環(huán)境濕度需求變化時，根據(jù)PID控制算法，SCR可控硅加濕器無級調(diào)節(jié)輸出精確的加熱量。

出愈率(%)=愈傷組織不再變化后的愈傷組織塊數(shù)/接種數(shù)×100

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

對各組培處理的發(fā)芽率、出愈率等數(shù)據(jù)，采用Excel統(tǒng)計分析軟件分別進行統(tǒng)計分析和顯著性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同6-BA濃度對黑麥草出愈率的影響

將經(jīng)過消毒處理的3個黑麥草品種的種子接種到不同培養(yǎng)基組合,分別進行暗培養(yǎng)1周后，黑麥草種子開始發(fā)芽，最終發(fā)芽率的統(tǒng)計結(jié)果表明(表1)，不同濃度的6-BA對黑麥草的發(fā)芽率影響不明顯，且黑麥草的發(fā)芽率對其愈傷組織出愈率影響也不明顯。因此，黑麥草的發(fā)芽率與6-BA的濃度相關(guān)不明顯，與其出愈率也無相關(guān)。

如表1所示，不同處理的黑麥草組織培養(yǎng)材料暗培養(yǎng)20 d后開始出現(xiàn)淡黃色的愈傷組織；40 d后統(tǒng)計不同處理組合的愈傷組織誘導(dǎo)率結(jié)果，不同濃度的6-BA處理，其黑麥草愈傷組織的誘導(dǎo)率不同。5種6-BA濃度處理中，0.05 mg/L的出愈率為42.1%,極顯著高于其他濃度處理的出愈率；0 mg/L和0.1 mg/L處理的出愈率分別極顯著高于0.2 mg/L和0.4 mg/L的處理。由此說明，在一定的濃度范圍內(nèi)，6-BA能夠提高黑麥草愈傷組織的出愈率，但濃度過高反而會降低黑麥草組織培養(yǎng)的出愈率。

表1 不同6-BA濃度處理的黑麥草發(fā)芽率與出愈率

注：表中不同小寫字母表示α=0.05水平上差異顯著,不同大寫字母表示α=0.01水平上差異極顯著。下同。

2.2 黑麥草品種對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2 不同品種的黑麥草發(fā)芽率與出愈率

從表2可知，不同黑麥草品種的發(fā)芽率差異不顯著，以沃土發(fā)芽率最高，但其出愈率卻最低，由此表明不同黑麥草品種的發(fā)芽率與其出愈率無關(guān)。不同黑麥草品種的愈傷組織誘導(dǎo)率不同，其中，特高的出愈率為34.9%，極顯著高于其他兩個黑麥草品種的出愈率；而雅晴與沃土的出愈率差異未達顯著水平。

2.3 不同基本培養(yǎng)基對黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)的影響

如表3所示，不同基本培養(yǎng)基的黑麥草種子暗培養(yǎng)1周后，種子開始發(fā)芽，不同基本培養(yǎng)基對黑麥草的發(fā)芽率影響不明顯，并且，發(fā)芽率對不同基本培養(yǎng)基的黑麥草出愈率影響也不明顯。結(jié)果表明，黑麥草的發(fā)芽率與基本培養(yǎng)基不存在明顯的相關(guān)，與其出愈率也不相關(guān)。

不同基本培養(yǎng)基的黑麥草暗培養(yǎng)20 d后開始出現(xiàn)淡黃色的愈傷組織。40 d后對愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計，結(jié)果表明：CC基本培養(yǎng)基的出愈率為42.2%,極顯著高于其他3種基本培養(yǎng)基；N6基本培養(yǎng)基的出愈率最低，僅為15.5%。不同基本培養(yǎng)基的出愈率大小依次為CC>MS>NB>N6。由此可知，黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)的最佳基本培養(yǎng)基是CC培養(yǎng)基。

表3 不同基本培養(yǎng)基的黑麥草發(fā)芽率與出愈率

3 討 論

3.1 6-BA濃度對黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)的影響

研究表明，黑麥草的愈傷誘導(dǎo)過程中，2,4-D濃度為5 mg/L時，在一定的范圍內(nèi)，加入不同濃度的6-BA，黑麥草的愈傷組織誘導(dǎo)率有所提高。如采用CC基本培養(yǎng)基，黑麥草品種特高在6-BA濃度為0 mg/L時，出愈率為51.1%，濃度為0.05 mg/L時，出愈率為67.8%，提高了16.7%。但隨著6-BA濃度的繼續(xù)增加，其出愈率反而明顯下降。這與杜雪玲等人的研究結(jié)果一致[18]。但與其他人的結(jié)論有差別，可能與所用的黑麥草品種有關(guān)，還需做進一步的研究。

3.2 影響黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)的因素

提高愈傷組織誘導(dǎo)率是建立植物組織培養(yǎng)再生體系的第一步,沒有高頻的誘導(dǎo)率,便無法得到大量的、高質(zhì)量的愈傷組織,其隨后的分化及生根便難以進行。

試驗表明，在一定的6-BA濃度范圍內(nèi)，能夠提高黑麥草愈傷組織的出愈率，這說明6-BA對愈傷組織誘導(dǎo)有促進作用。黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著的品種間差異，可能與品種遺傳基因型差異有關(guān)。本研究結(jié)果表明，CC培養(yǎng)基為最適宜的基本培養(yǎng)基,可能是因為CC培養(yǎng)基中添加了0.2 mol/L濃度的甘露醇,這可使該培養(yǎng)基維持在一個較高的滲透壓環(huán)境下，這種環(huán)境可能有利于黑麥草愈傷組織中內(nèi)源細(xì)胞分裂素和脫落酸含量的提高,而這些激素含量的提高有利于促進黑麥草體細(xì)胞胚胎的形成。

3.3 最佳黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)條件組合的選擇

試驗分析表明，不同6-BA濃度與不同黑麥草品種對黑麥草愈傷組織的出愈率均有極顯著的影響，而6-BA濃度與不同黑麥草品種之間的互作不顯著。通過多重比較，篩選出黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)條件的最佳水平組合為：6-BA濃度為0.05 mg/L與黑麥草特高品種的組合。

試驗分析表明，不同6-BA濃度與不同基本培養(yǎng)基對黑麥草愈傷組織出愈數(shù)均有極顯著影響，而6-BA濃度與不同基本培養(yǎng)基之間的互作不顯著。通過多重比較，篩選出黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)條件的最佳水平組合為：6-BA濃度為0.05 mg/L與CC培養(yǎng)基的組合。

試驗分析表明，不同黑麥草品種與不同基本培養(yǎng)基對黑麥草愈傷組織出愈數(shù)的差異未達顯著水平，而且，黑麥草品種與基本培養(yǎng)基之間的互作也未達顯著水平。通過多重比較，篩選出黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)條件的最佳水平組合為：黑麥草品種特高與CC培養(yǎng)基的組合。

綜上所述，通過不同6-BA濃度、不同黑麥草品種、不同培養(yǎng)基兩兩間的分析，最后篩選出黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)的最佳組合為：0.05 mg/L的6-BA濃度+黑麥草品種特高+CC基本培養(yǎng)基。

[1] 惠俊愛,吳少平,費永俊.黑麥草不同品種響應(yīng)植被砼干熱生境的抗性生理差異[J].中國草地學(xué)報,2007,19(4):45-47.

[2] 馮 霞,孫振元,韓 蕾,等.多年生黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生[J].草業(yè)科學(xué),2004,21(10):23-24. [3] Hiroshi Hisano,Akira Kanazawa,Akira Kawakami,et al.Transgenic perennial ryegrass plants expressing wheat fructosyl transferasegenes accumulate increased amounts of fructan and acquire increased tolerance on a cellular level to freezing[J].Plant Science,2004,167(2):861-868.

[4] 劉文真,玄松南,陳惠哲,等.幾種作用因子對多年生黑麥草組織培養(yǎng)影響的研究[J].林業(yè)科學(xué)研究,2004,23(1):95-101.

[5] 蔡 能,易自力,陳智勇,等.多年生黑麥草高頻再生體系的建立及優(yōu)化[J].中國草地學(xué)報,2007,29(4):45-49.

[6] Wu YY, Chen QJ, Chen M,et al.Salt tolerant transgenic perennial ryegrass(Lolium perenne L.) obtained by agrobacterium tumefaciens me diated transformation of the vacuolar Na+/H+ antiporter gene[J].Plant Science,2005,169(1):65-73.

[7] 王 艷,李建龍,潘永年,等.草坪草轉(zhuǎn)基因育種研究進展[J].草原與草坪,2007,(4):13-18.

[8] 張振霞,儲成才,席嘉賓,等.多年生黑麥草種子愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生[J].草地學(xué)報,2004,12(4):289-293.

[9] 馬莉貞.植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,12(15):21-23.

[10]易自力,陳智勇,蔣建雄,等.三種冷季型草坪草愈傷組織再生體系的建立[J].中南林學(xué)院學(xué)報,2005,25(1):25-28.

[11]周宜君,周生闖,劉 玉,等.植物生長調(diào)節(jié)劑對植物愈傷組織的誘導(dǎo)與分化的影響[J].中央民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2007,16(1):23-28.

[12]徐定炎,何陽鵬.種坯處理、不同激素濃度在暗培養(yǎng)條件下對多年生黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].浙江林業(yè)科技,2003,2(2):16-19.

[13]李 雪,韓烈保,陳季琴.多年生黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)與芽分化的研究[J].草業(yè)科學(xué),2005,12(5):45-48.

[14]杜雪玲,張振霞,劉 萍,等.2,4-D和6-BA對多年生黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)影響的研究[J].草原與草坪,2005,11(3):49-51.

[15]陳季琴,韓烈保,楊純奇,等.不同外植體對多年生黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].草原與草坪,2005,15(4):42-49.

[16]高 明,楊長海,譚旭華,等.冷地型草坪草組織培養(yǎng)現(xiàn)狀及評述[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,12(6)：34-36.

[17]余如剛,李陽春,夏 陽,等.影響禾本科草坪草愈傷組織分化頻率的因素[J].草原與草坪,2004,4(2):20-23.

[18]梁雪蓮,陳 平,黃 黌,等.草坪草細(xì)胞組織培養(yǎng)研究進展[J].北方園藝,2006,5(6):53-56.

[19]陳季琴,韓烈保.正交設(shè)計在多年生黑麥草組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].中國草地,2004,10(6):33-34.

[20]楊 茹,袁慶華,曹致中,等.2,4-D和BA對黑麥草不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響[J].中國草地學(xué)報,2008,16(4):34-38.

[21]謝宏偉，徐慶國，李 陽.黑麥草高溫脅迫抗性與抗旱性遺傳育種研究進展[J].作物研究，2011，25(1)：89-94.

PreliminaryStudiesonEffectsof6-BAonCallusInductioninRyegrass

WULian-rong,XUQing-guo*,LIHong,WUYi-jun,HUANGPing,ZHANGTing,ZHAOXin,LIBin,GAOWei

(Department of Grassland Science, College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

The mature seeds of three different ryegrass cultivars, perennial ryegrass Yatsyn and Pandora, and annual ryegrass Tetragold, were selected as explants, four types medium of CC, MS, NB, N6 were used, 5 mg/L of 2, 4-D and different concentration of 6-BA were added to each medium to study the callus induction in order to establish the regeneration system of ryegrass. The results showed that the callus induction rate of 3 ryegrass cultivars was highest when the concentration of 6-BA was 0.05mg/L. Under the same concentration of 6-BA, the callus induction rate existed significant differences among different ryegrass varieties. There existed effect of different basic medium on ryegrass callus induction rate, and the ryegrass callus induction rate was highest in CC treatment.

Ryegrass; Callus; 6-BA

吳蓮蓉(1990-)，女，湖南邵陽人。*通訊作者，Email：huxu0309@yahoo.com.cn。

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目；中國科學(xué)院植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點實驗室開放課題(Y052811t04)；湖南省科技廳項目(2010NK3014與10077)。

S543+.601

A

1001-5280(2012)01--03

10.3969/j.issn.1001-5280.2012.01.