MAT1基因沉默對胰腺癌細(xì)胞生長的影響

劉建平 陶永勝 李輝 張世能 袁世珍

·短篇論著·

MAT1基因沉默對胰腺癌細(xì)胞生長的影響

劉建平 陶永勝 李輝 張世能 袁世珍

我們既往的研究證實(shí)，作為調(diào)控細(xì)胞周期循環(huán)的關(guān)鍵基因之一，人類MAT1(ménage à trios 1)基因在胰腺癌組織中表達(dá)增強(qiáng)，它參與胰腺癌的發(fā)生[1-2]。轉(zhuǎn)染反義MAT1基因可使胰腺癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G1期阻滯[3]。為此，本研究應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄法合成靶向MAT1基因的小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)，轉(zhuǎn)染胰腺癌Capan-2細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)，探討siRNA沉默MAT1基因用于胰腺癌基因治療的可行性。

一、材料與方法

1．細(xì)胞培養(yǎng)及MAT1蛋白表達(dá)的檢測：人胰腺癌細(xì)胞株Capan-2從美國加州大學(xué)引進(jìn)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，裂解提取蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞MAT1蛋白表達(dá)。羊抗人MAT1多抗(Santa Cruz biotechnology公司)工作濃度1∶100，兔抗羊IgG單抗(Santa Cruz biotechnology公司)工作濃度1∶500，用PBS代替抗體作為陰性對照。細(xì)胞胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性[2]。

2．靶向MAT1的siRNA合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：參照Elbashir等[4]的哺乳動物細(xì)胞RNAi的“AA-N19”設(shè)計(jì)原則，以MAT1基因的cDNA序列為模板，篩選4條mRNA序列：序列1：5′-GGUGUUGUCCAAAUCCACAUU-3′；序列2：5′-GUCGUUCCACUUCUAAAGCUU-3′；序列3：5′-ACGUCACUGGUUUUACAGGUU-3′；序列4：5′-CUGUGGAAAACGUCA CUGGUU-3′。另設(shè)計(jì)1條陰性對照序列，5′-AGCGGAUCCAAUCUUUGUGUU-3′。 在GenBank數(shù)據(jù)庫中使用BLAST以確保目的序列與其他基因沒有同源性。然后根據(jù)堿基互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)出總長度為29個(gè)堿基的脫氧核苷酸鏈，共10條，由QIAGEN-Operon公司合成。采用SilencerTMsiRNA Construction Kit(Ambion公司)在體外轉(zhuǎn)錄合成4條21-nt的靶向MAT1的siRNAs(siRNA-MAT1)和陰性對照的siRNAs(siRNA-C)。用紫外分光光度儀檢測每一條siRNA的產(chǎn)量和純度，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物大小和完整性。用SilencerTMsiRNA Labeling Kit(cy3)(Ambion公司)標(biāo)記siRNAs，用SilencerTMsiRNA Transfection Kit(Ambion公司)將5條siRNAs分別轉(zhuǎn)染Capan-2細(xì)胞，在熒光顯微鏡下直接計(jì)數(shù)判斷轉(zhuǎn)染效率[2]。應(yīng)用4條siRNA-MAT1中轉(zhuǎn)染效率最高的細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

3．細(xì)胞生長曲線繪制：取對數(shù)生長期siRNA-MAT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞、siRNA-C轉(zhuǎn)染細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別以1×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔，其中未轉(zhuǎn)染細(xì)胞又分為Lipid對照組(培養(yǎng)液中加Lipid)和空白對照組。連續(xù)培養(yǎng)3 d，并于每天同一時(shí)間消化細(xì)胞，光鏡下直接計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量，按我們以往的方法[2]繪制各組細(xì)胞的生長曲線圖。

4．細(xì)胞周期及增殖指數(shù)檢測： 分別取siRNA-MAT1轉(zhuǎn)染組和空白對照組細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)3 d，按我們以往的方法[2]上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期曲線，并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1．Capan-2細(xì)胞的MAT1蛋白表達(dá)：MAT1蛋白在胰腺癌細(xì)胞株Capan-2中呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖1)。

圖1siRNA-MAT1轉(zhuǎn)染(a)和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(b)MAT1表達(dá)(×200)

2．siRNA-MAT1的轉(zhuǎn)染效率：Capan-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率>90%，轉(zhuǎn)染后Cy3熒光能持續(xù)96 h(圖2)。

圖2Capan-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-MAT1后的光鏡(a)及熒光顯微鏡下(b)照片(×400)

3．siRNA-MAT1轉(zhuǎn)染對Capan-2細(xì)胞增殖的影響：4條設(shè)計(jì)合成的siRNAs序列中有2條(序列2和序列3)可顯著抑制Capan-2細(xì)胞的生長，其中序列2在72 h后細(xì)胞生長抑制率為21.6%，96 h后的生長抑制率為26.7%；序列3在72 h后細(xì)胞生長抑制率達(dá)38.8%，96 h后的抑制率達(dá)41.8%(圖3)，二者有差異(P<0.01)，故選取序列3繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀分析顯示siRNA-MAT1(序列3)轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48 h后G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升，到72 h后已出現(xiàn)明顯的G0/G1期細(xì)胞滯留，S期細(xì)胞比例明顯下降，PI值亦明顯下降，有顯著性差異(表1)。

圖2 siRNA-MAT1(序列3)抑制BxPC3細(xì)胞增殖生長

組別轉(zhuǎn)染后24hG0/G1SPI空白對照組52．9±1．922．8±1．946．8±2．5轉(zhuǎn)染組53．5±1．926．1±1．8a47．1±1．8組別轉(zhuǎn)染后48hG0/G1SPI空白對照組54．5±1．130．6±1．245．5±1．2轉(zhuǎn)染組70．3±1．6b20．0±0．9a29．6±1．6b組別轉(zhuǎn)染后72hG0/G1SPI空白對照組57．9±1．624．3±1．942．1±1．7轉(zhuǎn)染組81．9±2．3b11．3±0．7b18．1±0．7b

注：與空白對照組比較，aP<0.05；bP<0.001

討論既往研究早已明確細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK )在細(xì)胞生長周期中所起的作用，而作為CDK的激活激酶(CDK activating kinase,CAK)是通過影響CDK的活性來控制細(xì)胞進(jìn)程的。MAT1基因是CAK這一三聚體復(fù)合物( MAT1/CDK7/Cyclin H)的重要組成部分，對CAK的活性起著分子開關(guān)的作用。 Rossi等[7]經(jīng)典的基因敲除實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，MAT1 (-/-)基因缺陷型小鼠細(xì)胞不能進(jìn)入S期，從而影響細(xì)胞的增殖和生長。Wu等[8]報(bào)道，轉(zhuǎn)導(dǎo)反義MAT1的RNA進(jìn)入骨肉瘤細(xì)胞株MG-63，72 h后細(xì)胞生長抑制率約33.3%，G0/G1期細(xì)胞比例由44.2%上升到67.0%。Zhang等[9]轉(zhuǎn)導(dǎo)反義MAT1的RNA進(jìn)入成神經(jīng)細(xì)胞瘤CHP126細(xì)胞中， 72 h后G0/G1期細(xì)胞比例由43%上升到66%。張世能等[3]證實(shí)，轉(zhuǎn)染反義MAT1的RNA進(jìn)入胰腺癌BxPC3細(xì)胞后,通過CAK磷酸化Rb途徑影響細(xì)胞周期蛋白，使細(xì)胞生長阻滯于G1期的晚期。Ohkawa等[10]發(fā)現(xiàn)，丙肝病毒核心能使MAT1從CAK中分離，從而削弱了細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化的能力?；贛AT1基因在調(diào)節(jié)信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)、控制細(xì)胞周期進(jìn)程、影響細(xì)胞增殖或凋亡等方面的關(guān)鍵性作用，可以推測，在未來的抗病毒治療(如艾滋病，病毒性肝炎)和腫瘤基因治療的靶目標(biāo)中，MAT1基因是值得期待的一個(gè)突破口[11-13]。

我們以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-MAT1 72 h后，胰腺癌BxPC3細(xì)胞生長明顯受抑制[2]。本實(shí)驗(yàn)在Capan-2細(xì)胞中又獲得相似結(jié)果，高比例的細(xì)胞滯留于G0/G1，未見明顯凋亡峰出現(xiàn)，再一次證實(shí)MAT1基因的正常表達(dá)是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期所必需的，單純下調(diào)MAT1蛋白的表達(dá)即可抑制腫瘤細(xì)胞生長，使其滯留于G0/G1期。我們以往的實(shí)驗(yàn)顯示，反義MAT1的RNA在非腫瘤細(xì)胞中可誘發(fā)明顯的細(xì)胞凋亡，但在腫瘤細(xì)胞中均未見凋亡峰出現(xiàn)[2-3,8-9]。本實(shí)驗(yàn)在Capan-2細(xì)胞中亦未誘發(fā)細(xì)胞凋亡，提示靶向MAT1基因的單純反義RNA或RNAi干擾沉默技術(shù)可能都不足以使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.016

518029 深圳，廣東省邊防總隊(duì)醫(yī)院消化內(nèi)科(劉建平、陶永勝、李輝)；中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科(張世能、袁世珍)

劉建平，Email: championliu@yahoo.com.cn

2011-06-24)

(本文編輯：屠振興)