苯酚對實驗紅鯽肝臟SOD和GSH-Px活性的影響

梁仕杰 高麗君 董先輝 姚 峰 吳端生▲

1.南華大學藥學與生命科學學院，湖南衡陽 421001；2.南華大學實驗動物學部，湖南衡陽 421001

苯酚對實驗紅鯽肝臟SOD和GSH-Px活性的影響

梁仕杰1△高麗君1董先輝1姚 峰2吳端生1▲

1.南華大學藥學與生命科學學院，湖南衡陽 421001；2.南華大學實驗動物學部，湖南衡陽 421001

目的 研究苯酚對實驗紅鯽肝臟中SOD和GSH-Px活性的影響。 方法 將40尾實驗紅鯽隨機分為空白對照組、2.16 mg/L、4.31 mg/L、8.60 mg/L、17.24 mg/L苯酚組，每組8尾。在染毒的24、48、72、96 h各組分別取2尾紅鯽的肝臟制成勻漿，檢測肝臟SOD和GSH-Px活性。 結(jié)果 苯酚對實驗紅鯽的96 h LC50為34.48 mg/L；隨著染毒濃度的增高和染毒時間延長，各染毒組紅鯽的SOD和GSH-Px的活性與對照組相比均升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結(jié)論 實驗紅鯽肝臟SOD和GSH-Px的活性與有機污染物苯酚之間存在劑量-反應和時間-效應關(guān)系。SOD和GSH-Px可作為生物標志物用于苯酚等有機污染物的監(jiān)測。

苯酚；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶；肝臟；紅鯽

苯酚（phenol）又名石碳酸，自1923年世界上采用苯磺化法首次生產(chǎn)苯酚以來，世界苯酚的生產(chǎn)迅速發(fā)展。苯酚已成為中國地表水中的第一大類水體污染物，對水生生態(tài)環(huán)境存在一定的生態(tài)風險。如果飲用或者食用污染水域中的水或水產(chǎn)，將直接影響到人體健康，這也是當前社會環(huán)保部門優(yōu)先檢測的污染物。苯酚屬細胞原漿型毒物，低質(zhì)量濃度下可造成蛋白變性，高質(zhì)量濃度時造成蛋白質(zhì)凝固，為神經(jīng)性毒劑[1]。其不僅可使污染水域中水生生物急性中毒死亡[2]，而且易在水生生物體內(nèi)積累和富集，從而危害人類的健康[3]。但目前的大多數(shù)研究主要關(guān)注其急性毒性[4]，對其效應質(zhì)量濃度長期作用下可能對水生生物體所引發(fā)的相應生化毒性研究不多[5-7]。多數(shù)污染物都具有氧化還原活性，能氧化損傷細胞，其機制是生成大量的活性氧自由基的有害產(chǎn)物，干擾生物正常的氧化還原循環(huán)[8]。當面臨污染脅迫時，機體會出現(xiàn)明顯的毒性效應，生物機體內(nèi)的抗氧化防御酶系的活性也會相應改變，因而能間接反映環(huán)境中氧化作用的存在，可作為衡量環(huán)境污染脅迫程度的指標[9]。作為一類可反映污染物對細胞氧化損傷程度的分子生態(tài)毒理指標，抗氧化防御酶系已逐漸成為了研究熱點。而在抗氧化防御酶系中發(fā)揮重要作用的是超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peratidase，GSH-Px）[10-16]。為此，本試驗選擇SOD和GSH-Px作為評價苯酚對魚體損傷程度的分子生物指標，研究在不同暴露濃度和不同作用時間下，苯酚對紅鯽肝臟SOD活性和GSH-Px活性的影響，為環(huán)境監(jiān)測和水環(huán)境風險評估提供參考，同時也為進一步了解苯酚毒理機制提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 試驗魚類

試驗魚類為實驗紅鯽，取自南華大學實驗動物學部，體質(zhì)健康，魚齡1.5年，平均體長（10.0±0.2） cm，平均體重（45.0±0.5） g，在水族箱內(nèi)馴養(yǎng)1周后用于實驗。養(yǎng)殖水體為曝氣3 d的自來水，pH=7.0，水溫（23±2）℃。

1.2 急性毒性實驗

按靜水毒性實驗法將實驗紅鯽暴露于含苯酚濃度為1.204、1.301、1.398、1.505、1.602、1.699、1.799 mg/L 共 7 個染毒組的水簇箱中，每個濃度再設(shè)3個平行組，每組飼養(yǎng)8尾，96 h后觀察并記錄實驗魚中毒與死亡狀況，按照參考文獻[2]計算出96 h LC50。

1.3 染毒

在急性毒性試驗基礎(chǔ)上，將實驗紅鯽分別飼養(yǎng)在5個實驗組的水簇箱中。其中設(shè)4個染毒組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）含苯酚濃度 分 別 為 96 h LC50 的 1/16、1/8、1/4、1/2，即 2.16、4.31、8.60、17.24 mg/L，另設(shè)1個空白對照組不含苯酚。每組飼養(yǎng)實驗紅鯽8尾，每個濃度設(shè)一個平行組。試驗期間每天換一半水，并補足苯酚至原來濃度，染毒96 h。

1.4 組織的提取和酶活性的測定

每個染毒組的實驗紅鯽，分別在染毒12、24、72、96 h后，取2尾魚解剖，提取肝臟，于生理鹽水中漂洗，洗去血液，濾紙吸干多余生理鹽水后稱重。將肝臟剪碎倒入勻漿器中研磨，每0.003克肝臟組織分別加入約3 mL和0.75 mL的生理鹽水制成0.1%和0.4%的肝組織勻漿液，前者用于SOD活性測定，后者用于GSH-Px測定，在4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液進行測定。本實驗用WST-1法測定試劑盒（購置于南京建成生物工程研究所）測定SOD活性，用GSH-Px試劑盒（購置于南京建成生物工程研究所）測定GSH-Px活性。測試過程參照試劑盒說明書。

1.5 蛋白含量測定

蛋白含量測定使用南京凱基生物科技發(fā)展有限公司的BCA蛋白含量測定試劑盒。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS11.5方差分析對染毒組和空白對照組的數(shù)據(jù)進行比較，分析苯酚對實驗紅鯽肝臟SOD和GSH-Px活性影響的劑量-效應與時間-效應關(guān)系，結(jié)果以（± s）表示，顯著性水平定為α=0.05，并用t檢驗法進行相關(guān)顯著性檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度下苯酚對SOD活性的影響

在苯酚暴露實驗開始觀察實驗紅鯽的中毒反應，染毒初期出現(xiàn)過分躁動活躍的情況，之后行動越來越緩慢，平衡感受到影響，身體傾斜，個別個體豎立懸浮于水中，并伴有魚鱗變黑，后期靜止在水底魚尾彎曲，呼吸微弱。苯酚對實驗紅鯽的96 h LC50為34.48 mg/L。苯酚對實驗紅鯽肝臟SOD活性影響的劑量-效應和時間-效應關(guān)系見表1和圖1。其中，SOD活性在2.16、4.31、8.60、17.24 mg/L的苯酚濃度范圍內(nèi)，隨著苯酚質(zhì)量濃度的增大，暴露時間的延長，SOD的活性也隨之增大。在染毒組Ⅰ，24 h 的 SOD 活性為（130.48±2.31）U/mgprot，高于空白對照組的127.38 U/mgprot，染毒組Ⅱ和染毒組Ⅲ的酶活性變化不顯著，但均高于染毒組Ⅰ。在染毒組Ⅰ和染毒組Ⅱ，48 h 的SOD活性接近，而染毒組Ⅲ與組Ⅳ的酶活性呈現(xiàn)上升的趨勢。在染毒組Ⅳ，48 h之前的SOD活性增強緩慢，為（165.94±8.58）U/mgprot，48 h之后的SOD活性迅速增強，至96 h時酶活性呈最大值，為（222.91±6.59）U/mgprot。

圖1 苯酚對實驗紅鯽肝臟SOD活性的影響

2.2 不同濃度下苯酚對GSH-Px活性的影響

苯酚對實驗紅鯽肝臟GSH-Px活性影響的劑量-效應和時間-效應關(guān)系見表2和圖2。表2和圖2顯示，在染毒24 h后，各個染毒組的GSH-Px活性都相對降低，降低的幅度隨著苯酚濃度的增大而增大；從24 ～96 h，隨著苯酚暴露時間的延長，GSH-Px活性逐漸升高。在染毒24 h后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組的GSH-Px 活 性 分 別 為（530.04±6.55）U/g、（522.59±4.34）U/g、（511.66±7.49）U/g、（478.34±5.44）U/g，均低于空白對照組。在染毒96 h后，Ⅳ組的GSH-Px活性值達到最大，為（906.76±4.79）U/g。

表1 苯酚對實驗紅鯽肝臟SOD活性的影響（ ± s，U/mgprot）

表1 苯酚對實驗紅鯽肝臟SOD活性的影響（ ± s，U/mgprot）

注：相同時間染毒組與對照組比較，aP＜0.05；不同時間染毒組與對照組比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h 96 h空白組 126.22±2.25 129.19±2.07 126.91±1.88 127.20±2.24Ⅰ組（2.16 mg/L） 130.48±2.31 144.16±6.15ab 169.47±7.95ab 179.59±8.24abⅡ組（4.31 mg/L） 130.44±4.69 148.31±7.58ab 168.96±6.31ab 173.79±5.72abⅢ組（8.60 mg/L） 141.71±5.39ab 152.50±5.19ab 175.65±7.97ab 183.14±3.98abⅣ組（17.24 mg/L） 150.52±6.59ab 165.94±8.58ab 222.72±4.88ab 222.91±6.59ab

表2 苯酚對實驗紅鯽肝臟GSH-Px活性的影響（± s，U/g）

表2 苯酚對實驗紅鯽肝臟GSH-Px活性的影響（± s，U/g）

注：相同時間染毒組與對照組比較，aP＜0.05；不同時間染毒組與對照組比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h 96 h空白組 547.61±2.46 550.38±3.02 549.35±2.32 547.14±2.69Ⅰ組（2.16mg/L） 530.04±6.55ab 534.09±6.81ab 614.02±4.97ab 627.03±7.36abⅡ組（4.31mg/L） 522.59±4.34ab 593.76±4.99ab 647.24±6.57ab 688.79±5.08abⅢ組（8.60mg/L） 511.66±7.49ab 629.64±8.40ab 749.43±7.60ab 810.43±5.60abⅣ組（17.24mg/L） 478.34±5.44ab 675.34±6.37ab 831.77±6.54ab 906.76±4.79ab

圖2 苯酚對實驗紅鯽肝臟GSH-Px活性的影響

3 討論

SOD和GSH-Px活性的高低與動物的抗逆性之間有一定的相關(guān)性，抗氧化酶活性的變化與環(huán)境中被污染的強度也具有相關(guān)性。在其耐受度內(nèi)，SOD和GSH-Px的活性會隨著污染強度的增加而增強[17-18]，隨活性氧自由基的增多而被誘導增加，抗氧化防御系統(tǒng)打開，刺激了SOD和GSH-PX等酶的合成，是生物對污染的適應性反應[19-20]。在正常生理條件下，機體內(nèi)的SOD和GSH-Px的合成量能滿足清除活性氧自由基的需要，但在疾病或者衰老的情況下，氧自由基的生成與清除則會失衡[21]，氧自由基可導致DNA斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶蛋白失活等毒性損傷。本實驗中，苯酚污染對實驗紅鯽肝臟SOD和GSH-Px的合成表現(xiàn)出了顯著的誘導作用（P＜0.01）,在96 h以內(nèi)，苯酚濃度低于17.24 mg/L的情況下，SOD的活性隨著苯酚的濃度的增加而增加。說明96 h的污染物暴露時間內(nèi)，17.24 mg/L還沒達到實驗紅鯽對苯酚污染的適應性反應到中毒反應的閾值，此時肝組織產(chǎn)生的活性氧能被及時清除。GSH-Px表現(xiàn)為在染毒后24 h后活性有所下降，在苯酚暴露初期，可能GSH-Px敏感性較SOD低，氧自由基在肝臟中有一定的積累，但尚未對GSHPx酶活性產(chǎn)生誘導，主要由SOD清除氧自由基，所以結(jié)果顯示GSH-Px活性下降，而SOD活性升高；隨著暴露時間延續(xù)，積累的氧自由基對酶產(chǎn)生了誘導作用，使GSH-Px活力代償性增強以清除體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基。有相關(guān)文獻研究劍尾魚和斑馬魚等的同類的實驗，實驗結(jié)果與本實驗符合，由此得出實驗紅鯽可以作為水源中一種優(yōu)良的安全指示生物。另外，兩種酶活性的變化表現(xiàn)出極大的相關(guān)性，更加證明SOD和GSH-Px在抗氧化酶系統(tǒng)中是協(xié)同作用的關(guān)系。

苯酚是常見的工業(yè)化工原料，也是水體中常見的有毒物質(zhì)，水中濃度過高會危害水生生物，同時也會污染周邊環(huán)境從而危害人們的健康。通過本實驗可以看出苯酚對動物的毒害程度，表明它對水生生態(tài)系統(tǒng)具有不可忽視的直接和潛在危害。從圖1和圖2中可以看出，實驗紅鯽肝組織中SOD和GSH-Px對苯酚濃度的變化極為敏感，極低濃度就能引起酶活性迅速發(fā)生改變，且變化程度與苯酚的濃度密切相關(guān)。作為敏感的分子生態(tài)毒理學指標，SOD和GSH-Px活性的檢測有望應用于水域環(huán)境苯酚污染的預警。同時，筆者應該重視周圍環(huán)境的保護，嚴格控制工業(yè)廢水的排放量，減少有毒有害物質(zhì)對水資源的污染，創(chuàng)造一個具有良好生態(tài)體系的淡水環(huán)境。

[1]陳佳榮.水化學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：200-201.

[2] 邢軍.苯、氯苯、苯酚、4-氯酚對斑馬魚、孔雀魚、劍尾魚的急性毒性[J].生態(tài)環(huán)境學報，2011，20（11）：1720-1724.

[3] 魏愛泓，徐虹，朱毅.鯉對酚的積累、分配和釋放研究[J].水產(chǎn)科學，2001，20（1）：12-14.

[4] 陳惠群，金珊.苯酚對革胡子鲇呼吸運動及心臟活動的影響[J].水利漁業(yè)，2000，20（5）：40-42.

[5] Liu J，Wang R，Huang B，et al. Biological effects and bioaccumulation of steroidal and phenolic endocrine disrupting chemicals in high-back crucian carp exposed to wastewater treatment plant effluents[J].Enviro- nmental pollution（Barking，Essex：1987）,2012，162：325-331.

[6] Sannadurgappa D，Ravindranath NH，Aladakatti RH.Toxicity，bioaccumulation and metabolism of phenol in the freshwater fish Oreochromis mossambicus[J].Journal of basic and clinical physiology and pharmacology，2007，18（1）：65-77.

[7] Sannadurgappa CD，Ravindranath NH，Aladakatti RH.Effect of phenol on the metabolism and biochemical composition of the freshwater fish Cyprinus carpio[J].Journal of basic and clinical physiology and pharma-cology，2006，17（4）：279-287.

[8] 劉祎男.苯、苯酚、硝基苯對水絲蚓的急性毒性及超氧化物歧化酶活性的影響 [J].水生生物學報，2008，32（3）：2-4.

[9] 陳家長，孟順龍，胡庚東，等.低濃度阿特拉津?qū)a魚過氧化氫酶（CAT）活性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2008，27（3）：1151-1156.

[10] Dudek H，F(xiàn)arbiszewski R，Michno T，et al.Activity of glutathione per oxidase（GSH2 Px）, glutathione reductase（GSSG2 R）and super oxide dismutase (SOD)in single brain metastasis[J].Wiad Lek，2002，55（526）：252-256.

[11] Lucena MI，Garcia-Martin E，Andrade RJ，et al.Mitochondrial superoxide dismutase and glutathione peroxidase in idiosyncratic drug-induced liver injury[J]. Hepatology（Baltimore，Md），2010，52（1）：303-312.

[12] Oleksiuk NP，Ianovych VH.The activity of pro-and antioxidant systems in the liver of freshwater fishes during different seasons[J].Ukrainskii biokhimicheskii zhurnal，2010，82（3）：41-48.

[13] Zachara BA，Gromadzinska J，Wasowicz W，et al.Red blood cell and plasma glutathione peroxidase activities and selenium concentration in patients with chronic kidney disease：a review[J].Acta biochimica polonica， 2006，53（4）：663-677.

[14] Kalpakcioglu B，Senel K.The interrelation of glutathione reductase，catalase，glutathione peroxidase， superoxide dismutase and glucose-6-phosphate in the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J].Clinical rheumatology，2008，27（2）：141-145.

[15] Lasota B，Blaszczyk B，Seremak B，et al.Selenium status and GSH-Px activity in semen and blood of boars at different ages used for artificial inseminati on[J].Reprod domest anim，2004，39（5）：309-314.

[16] Tondreau MY，Boucher E，Simard M，et al.Sex-specific perinatal expression of glutathione peroxidases during mouse lung development[J].Molecular and cellular endocrinology：2012，355（1）：87-95.

[17] Ling X，Zhang Y，Lu Y，et al.Superoxide dismutase，catalase and acetyl cholinesterase：biomarkers for the joint effects of cadmium，zinc and methyl parathion contamination in water[J].Environmental technology，2011，32（13-14）：1463-1470.

[18] 方展強，張鳳君，鄭文彪，等.多氯聯(lián)苯對劍尾魚超氧化物歧化酶活性的影響 [J].中國實驗動物學報，2004，12（2）：96-99.

[19] 趙元鳳，呂景才，宋曉陽，等.鎘污染對鰱魚超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性的影響[J].生物技術(shù)學報，2002，10（3）：267-271.

[20] Noschang C，Krolow R，Arcego DM，et al.Neonatal handling affects learning，reversal learning and antioxidant enzymes activities in a sex-specific manner in rats[J].International journal of developmental neuroscience：the official journal of the International Society for Developmental Neuroscience，2012.

[21] 賈秀英，陳志偉.鎘對鯽魚酶活性毒性的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2002，14（3）：155-158

Effects of phenol on the activity of SOD and GSH-Px in red crucian carp liver

LIANG Shijie1GAO Lijun1DONG Xianhui1YAO Feng2WU Duansheng1
1.College of Pharmacy and Life Science of Nanhua University,Hengyang 421001,China;2.Department of Laboratory Animal of Nanhua University,Hengyang 421001,China

ObjectiveTo investigate the effects of phenol on the activites of superoxide dismutase and glutathione peroxidase in red crucian carp liver.MethodsForty carassius auratus red variety were randomly and averagedly divided into one control group and four phenol groups:0,2.16 mg/L,4.31 mg/L, 8.60 mg/L,17.24 mg/L.The activities of SOD and GSHPx in liver of two carassius auratus red variety per group were respectively detected after 24 h,48 h,72 h,96 h.ResultsLC50 of phenol for 96 h was 34.48 mg/L in carassius auratus red variety.Compare to the control group,the activites of SOD and GSH-Px in liver of phenol groups were lower,and they increased with the dose increased,the differences were significant(P＜0.05).ConclusionThere was dose-response and time-response relationship between phenol and the activities of SOD and GSH-Px.The activities of SOD and GSH-Px can become biological marker which were used to detect the organic contaminants,phenol for example.

Phenol;Superoxide dismutase;Glutathione peroxidase;Liver;Carassius auratus red variety

R-332

A

2095-0616（2012）07-31-04

湖南省科研條件創(chuàng)新專項基金（2010TT1007）?！髂先A大學生物化學與分子生物學2009級在讀碩士研究生▲

2012-02-27）