乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素快速檢測試紙條研制

羅曉琴，劉 琳，劉文芳，崔彥虎，余厚美

（北京望爾生物技術(shù)有限公司，北京102206）

乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素快速檢測試紙條研制

羅曉琴，劉 琳，劉文芳，崔彥虎，余厚美

（北京望爾生物技術(shù)有限公司，北京102206）

通過β-內(nèi)酰胺類抗生素-載體蛋白偶聯(lián)物的合成，單克隆抗體的制備與純化，膠體金標記物的制備，β-內(nèi)酰胺類抗生素單克隆抗體-膠體金標記物的制備并凍干到微孔試劑，樣品吸收墊和反應膜的制備等研究過程，研制出乳制品中β-內(nèi)酰胺類抗生素的快速檢測試紙條。檢測限分別為：青霉素G 2μg/L、氨芐青霉素4μg/L、阿莫西林5μg/L、苯唑青霉素/鄰青霉素/雙青霉素均為6μg/L、頭孢洛寧10μg/L、萘夫西林20μg/L、頭孢喹肟20μg/L、頭孢曲松25μg/L、頭孢哌酮50μg/L、頭孢噻呋90μg/L；本試紙條特異性好、假陽性率不高于3%、假陰性率為0，檢測時間不超過15min，檢測限量達到了我國和歐盟的要求，適用于乳品流通環(huán)節(jié)乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測。

β-內(nèi)酰胺類抗生素，乳品，膠體金，試紙條

β-內(nèi)酰胺類抗生素是指化學結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素，主要包括青霉素類和頭孢菌素類，其作用特點是能夠抑制細菌黏肽轉(zhuǎn)肽酶的活性，從而阻止細菌細胞壁的合成，呈現(xiàn)殺菌活性[1]。β-內(nèi)酰胺類抗生素廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不當或不遵守休藥期規(guī)定等原因，極易殘留在使用組織中，造成嚴重危害：使人體產(chǎn)生耐藥菌株，給使用抗生素治療疾病帶來不良影響；出現(xiàn)過敏反應；破壞人體內(nèi)正常菌群的平衡狀態(tài)，甚至造成“二重感染”[2]。目前，牛奶及生鮮奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測方法依據(jù)不同的檢測原理，大體可分為三大類：微生物受阻檢測、理化檢測法、免疫學分析法。微生物受阻檢測方法主要有抑菌圈實驗、渾濁度實驗、變色型檢測金標試劑盒方法，其檢測成本價低，但是靈敏度低、耗時長、耐藥菌的存在容易導致誤檢；理化檢測方法有液相色譜法、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜法等，該檢測方法精確度高，但其存在檢測成本高，檢測設備復雜，對檢測人員的要求較高，檢測耗時長等缺點。免疫分析法由于具有快速、靈敏、特異等特點常用于檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素，目前主要為酶聯(lián)免疫檢測法和放射免疫分析法[3]。我國原料乳中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留嚴重，對其開展監(jiān)控檢測是我國乳業(yè)發(fā)展中極為關注的問題，研制β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留快速檢測的方法勢在必行，本研究采用膠體金免疫法開發(fā)了一種快速準確檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素的試紙條。我國235號文件規(guī)定的牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物限量要求如下：苯唑西林30μg/L、氯唑西林30μg/L、頭孢噻呋100μg/L、頭孢喹肟20μg/L、頭孢氨芐100μg/L、氨芐西林10μg/L、阿莫西林10μg/L。歐盟對牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物限量要求如下：青霉素G 4μg/L、氨芐青霉素4μg/L、阿莫西林4μg/L、苯唑青霉素30μg/L、鄰青霉素30μg/L、雙青霉素30μg/L、萘夫西林30μg/L、頭孢喹諾20μg/L、頭孢乙腈125μg/L、頭孢洛寧20μg/L、頭孢唑林50μg/L、頭孢哌酮50μg/L、先鋒霉素Ⅷ60μg/L、頭孢噻呋100μg/L[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1%氯金酸 sigma公司；檸檬酸三鈉 廣州化學試劑廠；磷酸鹽緩沖液（簡稱PBS） 含酪蛋白、吐溫-80的0.02mol/L、pH7.2的磷酸鹽溶液，其中酪蛋白在復溶緩沖液中的終濃度為0.05%~0.1%（體積百分含量），吐溫-80在復溶緩沖液中的終濃度為0.05%~ 0.15%（質(zhì)量百分含量）；雙蒸水，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（簡稱EDC），N-羥基琥珀酰亞胺（簡稱NHS），卵清蛋白，牛血清白蛋白。

微量移液器 單道20~200μL和100~1000μL、多道50~300μL，美國Thermo；離心機TDL-408等 上海安亭。

1.2 頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定

頭孢類藥物是小分子物質(zhì)，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。

1.2.1 免疫原的制備-頭孢類藥物與卵清蛋白偶聯(lián)物合成 取頭孢匹林的鈉鹽40mg，用1.5mL雙蒸水溶解，得到（Ⅰ）液；取1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（簡稱EDC）40mg和N-羥基琥珀酰亞胺（簡稱NHS）60mg用0.5mL水溶解得到（Ⅱ）液；在攪拌狀態(tài)下將（Ⅱ）加入（Ⅰ）中，反應1h，得到（Ⅲ）液；取卵清蛋白60mg用8mL水溶解，得到（Ⅳ）液；將（Ⅳ）加入（Ⅲ）中，室溫攪拌反應24h分別得到免疫原，用0.02mol/LPBS緩沖液透析3d，分裝、凍存。

1.2.2 包被原的制備-頭孢類藥物與牛血清白蛋白偶聯(lián)物合成 取頭孢匹林的鈉鹽40mg，用1.5mL雙蒸水溶解，得到（Ⅰ）液；取EDC 40mg和NHS 60mg用0.5mL水溶解得到（Ⅱ）液；在攪拌狀態(tài)下將（Ⅱ）加入（Ⅰ）中，反應1h，得到（Ⅲ）液；取牛血清白蛋白100mg用8mL水溶解，得到（Ⅳ）液；將（Ⅳ）加入（Ⅲ）中，室溫攪拌反應24h分別得到包被原，用0.02mol/L PBS透析3d，分裝、凍存。

1.2.3 頭孢類藥物-載體偶聯(lián)物的鑒定 將載體蛋白、頭孢類藥物、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS調(diào)零，用紫外分光光度計在波長200~800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、頭孢類藥物、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明頭孢類藥物與載體蛋白偶聯(lián)成功。

1.3 頭孢類藥物單克隆抗體的制備

頭孢類藥物單克隆抗體的制備主要包括動物免疫、細胞融合和克隆化、細胞凍存和復蘇以及單克隆抗體的制備和純化。

1.3.1 動物免疫 將1.2得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150μg/只，使其產(chǎn)生抗血清。

1.3.2 細胞融合和克隆化 取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9∶1（數(shù)量配比）比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌頭孢類藥物單克隆抗體的頭孢類藥物單克隆雜交瘤細胞株。

1.3.3 細胞凍存和復蘇 將雜交瘤細胞用凍存液制成1×109個/mL的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.4 單克隆抗體的制備與純化 增量培養(yǎng)法：將雜交瘤細胞置于細胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。所述細胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為20%（質(zhì)量百分含量），使碳酸氫鈉在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為0.2%（質(zhì)量百分含量）；所述細胞培養(yǎng)基的pH為7.4。

1.4 羊抗鼠抗抗體的制備

以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。

1.5 頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的制備

先制備好膠體金標記物，再向膠體金標記物中加入1.3.4制備好的單克隆抗體，形成頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物。

1.5.1 膠體金的制備 用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%（質(zhì)量百分含量），置磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，每100mL 0.01%氯金酸加入2.5mL 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌加熱反應至液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。

1.5.2 頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的制備 在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金的pH至7.0，按50~100mg抗體/mL膠體金的標準向膠體金溶液中加入上述頭孢類藥物單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入10%BSA至BSA在膠體金溶液中的終濃度為1%（體積百分含量），靜置30min。12000r/min、4℃離心30min，棄上清液，沉淀用復溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/20的復溶緩沖液將沉淀重懸，得到的頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物溶液的濃度為50μg單抗/mL溶液，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的凍干

向微孔試劑微孔板中加入100μL頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物，放入冷凍干燥機中，冷阱溫度為-70℃條件下，預凍4h后，再凍干14h，即可取出，得到凍干有頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑。

1.7 樣品吸收墊的準備

將樣品吸收墊置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為體積百分含量0.5%）、pH為7.2、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37℃烘2h備用。

1.8 反應膜的制備

包被過程：用磷酸緩沖液將頭孢類藥物-牛血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/mL，用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)，包被量為1.0μg/cm2；用0.01mol/L、pH7.4 PBS緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200μg/mL，用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控區(qū)，包被量為1.0μg/cm2。將包被好的反應膜置于37℃條件下干燥2h，備用。

1.9 試紙條檢測方法

取所需數(shù)目的試紙條、微孔試劑、奶樣（液體）以及相關其他試劑恢復至室溫，吸取待檢牛奶樣品溶液，滴加200μL于微孔中，緩慢抽吸5次，充分與微孔中試劑混合，混合液顏色呈均勻粉紅色，開始計時。室溫下孵育5min，將標記好的試紙條插入微孔中（印有“max”線端朝下，使之充分浸入溶液中），微孔中的試劑與牛奶樣品反應，再次室溫孵育5min后，液體會沿著試紙條垂直向上依次通過試紙條的檢測線和對照線，當樣品中沒有β-內(nèi)酰胺類抗生素時，試紙條的檢測線和對照線處出現(xiàn)紅色條帶；當樣品中存在β-內(nèi)酰胺類抗生素時，試紙條的檢測線處不出現(xiàn)紅色條帶，僅對照線處出現(xiàn)紅色條帶，如圖1所示。

圖1 檢測結(jié)果示意圖Fig.1 Sketch of detection results

1.10 牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素測定

實驗測定β-內(nèi)酰胺類抗生素試紙條靈敏度、特異性以及假陽性率和假陰性率。

1.1 0.1 試紙條檢測限測定 在空白牛奶樣品分別添加青霉素G標準品至終濃度分別為1、2、4μg/L；分別添加氨芐青霉素標準品至終濃度為2、4、8μg/L；分別添加阿莫西林標準品至終濃度為2.5、5、10μg/L；分別添加苯唑青霉素、鄰青霉素、雙青霉素標準品至終濃度為3、6、12μg/L；分別添加頭孢洛寧標準品至終濃度為5、10、20μg/L；分別添加萘夫西林和頭孢喹肟標準品至終濃度為10、20、40μg/L；分別添加頭孢曲松標準品至終濃度為10、25、50μg/L；分別添加頭孢哌酮標準品至終濃度為20、50、100μg/L；分別添加頭孢噻呋標準品至終濃度為45、90、180μg/L，取試紙卡進行測試，每個濃度重復測定5次，以驗證本試紙卡的檢測限。所用的稀釋液為pH7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。

1.1 0.2 特異性實驗 特異性常用交叉反應率表示，是指抗體與結(jié)構(gòu)不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力。將牛奶中常檢的其他藥物（克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、群勃龍醋酸酯、磺胺類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類）用pH為7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液進行稀釋，用試紙條進行檢測。

1.1 0.3 試紙卡的假陽性率、假陰性率測定 取空白牛奶樣品50份，計算出假陽性率。取添加青霉素G濃度為2μg/L的陽性牛奶樣品50份，計算出假陰性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 試紙卡檢測限測定結(jié)果與分析

表1 試紙卡檢測限測定結(jié)果Table 1 The detection limit of strips

由上述測定結(jié)果可知，本試紙條對以下藥物的檢測限分別為：青霉素G2μg/L、氨芐青霉素4μg/L、阿莫西林5μg/L、苯唑青霉素/鄰青霉素/雙青霉素均為6μg/L、頭孢洛寧10μg/L、萘夫西林20μg/L、頭孢喹肟20μg/L、頭孢曲松25μg/L、頭孢哌酮50μg/L、頭孢噻呋90μg/L，都已達到了我國和歐盟規(guī)定的檢測限量要求。

2.2 試紙卡特異性結(jié)果及分析

結(jié)果顯示，克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、群勃龍醋酸酯、磺胺類藥物、氯霉素類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類藥物在500μg/L濃度時，試紙條質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)均顯色，由此可知本試紙條未對這些藥物發(fā)生交叉反應。

2.3 試紙卡的假陽性率、假陰性率測定結(jié)果及分析

表2 試紙卡假陽性率、假陰性率測定結(jié)果Table 2 The false positive rate and false negative rate of strips

所檢50份空白牛奶樣品的檢測結(jié)果1份陽性，其余均為陰性，試紙卡假陽性率不高于3%；青霉素G添加濃度為2μg/L的50份陽性樣品的檢測結(jié)果均為陽性，試紙卡假陰性率為0。

3 結(jié)論

通過實驗和測定結(jié)果顯示，本快速檢測試紙條用于測定牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留可行，檢測限分別為：青霉素G 2μg/L、氨芐青霉素4μg/L、阿莫西林5μg/L、苯唑青霉素、鄰青霉素、雙青霉素均為6μg/L、頭孢洛寧10μg/L、萘夫西林20μg/L、頭孢喹肟20μg/L、頭孢曲松25μg/L、頭孢哌酮50μg/L、頭孢噻呋90μg/L，與牛奶中其他藥物不發(fā)生交叉反應，假陽性和假陰性的可能性較小，檢測時間短?？勺鳛槟膛?、乳制品廠、政府監(jiān)督部門、出入境檢測以及大型食品流通領域等篩查乳制品中β-內(nèi)酰胺類抗生素的首選產(chǎn)品，使牛奶中抗生素問題得到有效監(jiān)控，符合最大殘留限量標準。

[1]張繼明.β-內(nèi)酰胺類抗生素的藥理研究進展[J].知識經(jīng)濟，2009（7）：94.

[2]謝會玲，陳偉，彭池方，等.動物源性食品中β-內(nèi)酰胺類抗生素多殘留免疫分析方法研究進展[J].食品科學，2008，29（7）：490-494.

[3]姜侃，陳宇鵬，金燕飛，等.應用酶聯(lián)免疫法快速檢測乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留[J].中國乳品工業(yè)，2010，38（1）：51-54.

[4]Janine Lamar，Michael Petz.Development of a receptor-based microplate assay for the detection of beta-lactam antibiotics in different food matrices[J].Analytica Chimica Acta，2007，586：296-303.

Development of the rapid detection strip for β-lactam antibiotics in dairy

LUO Xiao-qin，LIU Lin，LIU Wen-fang，CUI Yan-hu，YU Hou-mei
（Beijing Wanger Biotechnology Co.，Ltd.，Beijing 102206，China）

This study developed a strip which can detect β-lactam antibiotics in dairy products quickly，through producing class antibiotic rapid detection strip，through the synthesis of the conjugate of β-lactam antibiotics and carrier protein，preparation and purification of monoclonal antibody，preparation of colloidal gold markers，preparation of the conjugate of β-lactam antibiotics monoclonal antibody and colloidal gold markers，preparation of sample absorption mat and reaction film and any other process.The strip can detect for penicillin G 2μg/L，ampicillin 4μg/L，amoxicillin 5μg/L，oxacillin，cloxacillin，dicloxacillin 6μg/L，cefalonium 10μg/L，nafcillin，20μg/L，cefquinome 20μg/L，ceftriaxone 25μg/L，cefoperazone 50μg/L，ceftiofur 90μg/L，the detection sensitivity was respectively.The false positive rate was less than 3%，and the false negative rate was 0.The detection time was less than 15min.The reported results indicated that the developed assay had the potential to emerge into a screening assay for routine use.For this purpose current work was ongoing to include all beta-lactams for which MRLs were set，to extend the range of matrices and to perform a full validation according to the principles of EU decision. Key words：β-lactam antibiotics；dairy；colloidal gold；strips

TS252.7

A

1002-0306（2012）03-0309-04

2011－01－21

羅曉琴（1984-），女，本科，研究方向：食品安全與檢測。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2010AA10Z402）。