自制梅毒、丙肝、艾滋病抗體復(fù)合質(zhì)控品的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

周志米張曉燕

(1.臺(tái)州市博愛醫(yī)院,浙江 臺(tái)州 318050;2.臺(tái)州曙光醫(yī)院,浙江 臺(tái)州 318050)

自制梅毒、丙肝、艾滋病抗體復(fù)合質(zhì)控品的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

周志米1張曉燕2

(1.臺(tái)州市博愛醫(yī)院,浙江 臺(tái)州 318050;2.臺(tái)州曙光醫(yī)院,浙江 臺(tái)州 318050)

目的評(píng)價(jià)自制多項(xiàng)目復(fù)合免疫定性分析(包含梅毒螺旋體抗體,丙型肝炎病毒抗體,艾滋病病毒抗體)質(zhì)控品的穩(wěn)定性。方法 用陽性對(duì)照稀釋法制備的復(fù)合質(zhì)控品在-20℃以下保存及復(fù)溶后2～8℃保存的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果自制質(zhì)控品-20℃以下保存穩(wěn)定至少6個(gè)月以上,但因復(fù)溶后穩(wěn)定性不佳應(yīng)分小瓶一日用量分裝。結(jié)論 自制復(fù)合免疫定性質(zhì)控品-20℃以下保存穩(wěn)定性較好,分小瓶分裝復(fù)溶后當(dāng)天使用穩(wěn)定性良好,基本能滿足基層實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控的要求。

免疫定性分析 自制質(zhì)控品 穩(wěn)定性

隨著酶標(biāo)儀在基層實(shí)驗(yàn)室的普及,以往用肉眼和經(jīng)驗(yàn)判斷的純定性試驗(yàn)逐漸被用酶標(biāo)儀根據(jù)cut off值判定結(jié)果的數(shù)值化定性試驗(yàn)所取代。在臨床實(shí)驗(yàn)室中質(zhì)控品是保證室內(nèi)質(zhì)量工作的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1],而目前國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室免疫定性分析的質(zhì)控品主要來自國外進(jìn)口,存在單一項(xiàng)目且價(jià)格昂貴,讓中小型醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室望而卻步,在基層實(shí)驗(yàn)室推廣困難等諸多問題。鑒于上述情況,作者結(jié)合近幾年的工作實(shí)踐自制了一種以正常人血清為基質(zhì),包含梅毒螺旋體抗體(TP)、丙型肝炎病毒抗體(HCV)、艾滋病病毒抗體(HIV)三類標(biāo)志物的復(fù)合質(zhì)控品?，F(xiàn)對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 ST-360酶標(biāo)儀和ST-36W洗板機(jī)(上?？迫A實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)有限公司);人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司);梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒(英科新創(chuàng)科技有限公司);丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒(英科新創(chuàng)科技有限公司)。

1.2 質(zhì)控品的制備

1.2.1 血清基質(zhì)的制備 收集正常人血清(所有肝炎標(biāo)志物及HIV均陰性且無溶血或脂血)一定量,混勻后以3500～4500g/min離心5分鐘,過濾除去殘留的纖維蛋白和血細(xì)胞成份,56℃加熱30分鐘滅活后制得質(zhì)控品血清基質(zhì)。

1.2.2 稀釋度的確定 用上述血清對(duì)HIV陽性對(duì)照(HIV-Ⅰ型和HIV-Ⅱ型陽性對(duì)照等量混合)做5～100倍系列稀釋,測(cè)定HIV抗體的滴度和各稀釋度的質(zhì)控物吸光度值,每稀釋度平行做3孔,取其平均值。按照HIV抗體弱陽性(S/CO=2.0～2.9)的標(biāo)準(zhǔn),確定外部質(zhì)控血清的稀釋度。HCV和TP稀釋度的確定方法同上。

1.2.3 根據(jù)確定的稀釋度用制備的血清稀釋陽性對(duì)照至目標(biāo)濃度(S/CO=2.0～2.9)的復(fù)合質(zhì)控品。將質(zhì)控血清用0.2μm濾膜過濾除菌,按5天試驗(yàn)用量分裝、標(biāo)記、封口,-20℃以下保存。

1.3 方法

1.3.1 三種抗體的檢測(cè)方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),按各自的操作SOP文件進(jìn)行操作。

1.3.2 -20℃保存穩(wěn)定性試驗(yàn) 將制備的質(zhì)控品在-20℃冰箱分別保存1、6、12個(gè)月后再進(jìn)行三種抗體檢測(cè),質(zhì)控品復(fù)溶后限當(dāng)天使用,每份標(biāo)本測(cè)定3次取平均值,結(jié)果用吸光度(OD)值表示,并計(jì)算求得每組數(shù)據(jù)的變異系數(shù)(CV)值,見表1。

1.3.3 每份質(zhì)控品復(fù)溶后2～8℃保存連續(xù)使用5天,每天隨標(biāo)本檢測(cè)1次,并以5天為周期,連續(xù)監(jiān)測(cè)20個(gè)周期,得到各項(xiàng)目在不同使用天數(shù)時(shí)的均值和變異系數(shù)(CV)值,見表2。

表1 自制復(fù)合質(zhì)控品第1、6、12個(gè)月結(jié)果比較(n=20)

表2 自制復(fù)合質(zhì)控品復(fù)溶后第1、2、3、4、5天結(jié)果比較(n=20)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù),進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)和兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 -20℃保存第1、6、12個(gè)月后檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 自制質(zhì)控品復(fù)溶后2～8℃保存第1天與第2、3天比較無顯著性差異(P＞0.05),與第4、5天比較有顯著性差異(P＜0.05)。

3 討 論

3.1 自制外部質(zhì)控的基質(zhì)應(yīng)盡量選擇人血清基質(zhì),動(dòng)物源性的基質(zhì)由于人體內(nèi)有大量的異嗜性抗體的存在引起非特異或中和反應(yīng)造成假失控,所以應(yīng)避免使用動(dòng)物源性的小牛血清,最好也不用生理鹽水或其他緩沖液稀釋,以保證蛋白質(zhì)處于天然的濃度和狀態(tài),不加任何防腐劑,同時(shí)制備足夠的量以維持一定的時(shí)間,建議每年制備1次。

3.2 自制質(zhì)控品能用于艾滋病酶聯(lián)免疫室內(nèi)質(zhì)控[2]。實(shí)驗(yàn)證明自制質(zhì)控品同樣適用于丙肝抗體和梅毒螺旋體抗體酶聯(lián)免疫室內(nèi)質(zhì)控。自制質(zhì)控血清與試劑是一個(gè)批號(hào)包裝,為一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng),基

質(zhì)效應(yīng)最小,可將質(zhì)控與陽性合為一孔,因?yàn)殛栃詫?duì)照只用作指示反應(yīng),稀釋后的陽性質(zhì)控品結(jié)果陽性,其原陽性對(duì)照肯定是陽性,同樣可起指示反應(yīng)作用,從而節(jié)省資源。

3.3 自制質(zhì)控血清穩(wěn)定性觀察,第1、6、12個(gè)月檢測(cè)的(ˉx±s),CV比較無顯著性差異(P＞0.05)。說明自制復(fù)合質(zhì)控品冷凍保存穩(wěn)定,免疫質(zhì)控的穩(wěn)定性要求瓶間變異小于20%,而作者比較各月的變異在12%～17%之間,表示該質(zhì)控品處于良好穩(wěn)定狀態(tài)。

3.4 質(zhì)控品復(fù)溶后三天內(nèi)穩(wěn)定,這與鮑作義等[3]關(guān)于HIV抗體質(zhì)控品穩(wěn)定性的報(bào)道結(jié)果相符,但從試驗(yàn)結(jié)果可見,第2、3天的CV較第1天要偏大,所以作者認(rèn)為自制質(zhì)控品最好是分小瓶1天用量分裝為佳。

[1] 王治國,李小鵬.臨床檢驗(yàn)定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)控系統(tǒng)的建立.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2004,19(1):6

[2] 張桂芳.HIV病抗體外部質(zhì)控血清的制備及評(píng)估.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,23(1):110

[3] 鮑作義,李敬云,劉思揚(yáng).HIV抗體抗質(zhì)控血清穩(wěn)定性研究.中國艾滋病性病,2002,8(3):137