左氧氟沙星熱敏型耳用凝膠的制備及其性能檢測(cè)

李聰 楊希之 敖華飛 孔德秋

化膿性中耳炎是耳鼻咽喉科常見(jiàn)疾病，其病理改變主要是中耳鼓室黏膜化膿性炎癥，主要的治療方式是抗菌藥物的使用。左氧氟沙星是一種廣譜、高效的喹諾酮類(lèi)抗菌藥;泊洛沙姆407是研究、應(yīng)用最為廣泛的一種熱敏型凝膠，且具有低溫時(shí)為液態(tài)，溫度升高時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z的反向熱敏凝膠特性。這樣便可以液體形式給藥，藥液在中耳內(nèi)立刻轉(zhuǎn)變成凝膠，能夠達(dá)到延長(zhǎng)藥物在中耳內(nèi)的滯留時(shí)間，提高藥物生物利用度的效果。目前在眼部［1］、直腸［2］、陰道［3］給藥系統(tǒng)中都有過(guò)應(yīng)用報(bào)道，但在耳科罕見(jiàn)類(lèi)似報(bào)道，故我們以泊洛沙姆407為基質(zhì)制備耳用凝膠，并對(duì)其體外釋放性能進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料 左氧氟沙星(上海楷洋生物有限公司);泊洛沙姆407(poloxamer 407，P407;商品名為普朗尼克F127，平均相對(duì)分子質(zhì)量:11500，上?？笊镉邢薰?;左氧氟沙星對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);其他試劑均為分析純。等滲磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(1000 mL溶液中含NaH2PO41.60 g，Na2HPO47.58 g，NaCl 4.32 g，調(diào) pH 值至7.40)。

MD100-1電子天平(上海天平儀器廠)，88-I型定時(shí)恒溫磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器有限公司)，DK-8D型電熱恒溫槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Smart Spec型分光光度計(jì)(BIO-RAD公司，美國(guó))，TK-20A型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 左氧氟沙星熱敏型凝膠的制備 采用冷溶法制備，稱(chēng)取不同質(zhì)量的P407，用注射用水配成等量不同濃度的溶液。另外稱(chēng)取等量左氧氟沙星加入各種溶液中，使各溶液中左氧氟沙星濃度為3 g/L，磁力攪拌器攪拌均勻，置4℃左右冰箱冷藏溶脹24 h，使凝膠充分溶脹，分散均勻，得澄清溶液。

1.2.2 相轉(zhuǎn)變溫度的測(cè)定 分別對(duì)不同濃度的P407溶液和上述制備的含左氧氟沙星的P407凝膠溶液進(jìn)行相轉(zhuǎn)變溫度測(cè)定。取一定量的溶液置于試管中，將溫度計(jì)插入凝膠溶液中，將試管置于恒溫水浴中，緩慢升溫，升溫速率約每1～2 min升高1℃;后將試管傾斜90°，觀察內(nèi)容物不流動(dòng)時(shí)的溫度稱(chēng)為相轉(zhuǎn)變溫度。每個(gè)樣品測(cè)3次，結(jié)果取平均值，根據(jù)適宜耳用的相轉(zhuǎn)變溫度選擇合適的樣品濃度。

1.2.3 體外釋放度的測(cè)定

1.2.3.1 紫外吸收光譜及測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取處方量左氧氟沙星，用注射用水稀釋成約10 mg/L溶液。另外選擇按處方比例配制的釋放介質(zhì)——等滲PBS，以注射用水為空白對(duì)照在200～400 nm波長(zhǎng)的范圍內(nèi)掃描，得到紫外吸收光譜(圖1)。結(jié)果表明:左氧氟沙星在293 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，而PBS在此波長(zhǎng)吸收甚微，兩者能較好分離，故選擇293 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1.紫外吸收光譜圖

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱(chēng)取左氧氟沙星對(duì)照品50 mg，置于50 mL量瓶中;加釋放介質(zhì)溶解稀釋至刻度，定容搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05 mL，分別置于100 mL量瓶中，加釋放介質(zhì)至刻度搖勻。以釋放介質(zhì)為空白對(duì)照，在293 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度左氧氟沙星溶液的吸光度(A)，結(jié)果在 3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5 mg/L 濃度時(shí)，A 分別為 0.213、0.328、0.453、0.586、0.704、0.793。以濃度(C)對(duì)吸光度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 C(mg/L)=12.582A+0.2976(r=0.9986，n=6)，繼而表明左氧氟沙星的檢測(cè)濃度在3.0～10.5 mg/L范圍內(nèi)和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3.3 精密度試驗(yàn) 按照“1.2.3.2”項(xiàng)下的方法制備高、中、低 3 種濃度(10.5、6.0、3.0 mg/L)的左氧氟沙星對(duì)照液各3份，室溫閉光放置，分別于同一天不同時(shí)間測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)左氧氟沙星吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation，RSD)為 1.032%(n=5);再分別于5 d內(nèi)每天測(cè)定1次，計(jì)算日間RSD為1.639%，結(jié)果均符合方法學(xué)要求。

1.2.3.4 回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量(3 g/L)的左氧氟沙星熱敏型凝膠2 ml，共6份，分別置于50 mL量瓶中;分別精密加入左氧氟沙星對(duì)照品儲(chǔ)備液3.0、4.0、5.0 mL，每個(gè)濃度各 2 份，加釋放介質(zhì)至刻度搖勻;再精密量取1 mL，置于50 mL量瓶中，加釋放介質(zhì)稀釋至刻度、搖勻，分別測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

由表1可見(jiàn):回收率結(jié)果符合方法學(xué)要求。

1.2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 平行精密量取5份左氧氟沙星熱敏型凝膠各1 mL，分別置于500 mL量瓶中;加釋放介質(zhì)稀釋至刻度搖勻，分別測(cè)定吸光度并計(jì)算左氧氟沙星的含量，RSD為0.61%，結(jié)果顯示試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

1.2.4 體外凝膠釋藥試驗(yàn) 選用Franz立式擴(kuò)散池模型，采用TK-20A型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀。將透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀的水浴箱控制在36.0℃恒溫，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/min;分別在給藥池和接受池內(nèi)加入配制的左氧氟沙星熱敏型凝膠和等滲PBS(保證PBS與皮面之間充分接觸，無(wú)氣泡)，每隔一定時(shí)間取樣1 mL，然后補(bǔ)加相同體積的PBS。以釋放介質(zhì)為空白對(duì)照，測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)取樣的吸光度，進(jìn)而得到不同時(shí)間點(diǎn)的左氧氟沙星熱敏型凝膠的累計(jì)藥物釋放量。

2 結(jié)果

2.1 左氧氟沙星熱敏型凝膠處方的設(shè)計(jì) 制備左氧氟沙星熱敏型凝膠的目的主要是使該給藥系統(tǒng)在低溫時(shí)為流動(dòng)性較好的液態(tài)，而中耳灌注后能夠在體溫下發(fā)生相轉(zhuǎn)變，形成半固體凝膠。本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的P407溶液(16%、17%、18%、19%、20%)相轉(zhuǎn)變溫度，同時(shí)考察了不同濃度的P407添加一定量的左氧氟沙星(3 g/L)后對(duì)凝膠相轉(zhuǎn)變溫度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2.不同溶液條件的P407濃度與凝膠溫度的關(guān)系

結(jié)果表明:隨著聚合物中P407濃度的增加，相轉(zhuǎn)變溫度逐漸降低;左氧氟沙星的加入對(duì)P407的相轉(zhuǎn)變溫度影響不大。以最接近人體中耳內(nèi)的溫度34℃左右作為相轉(zhuǎn)變溫度篩選的依據(jù)，因濃度為17%的P407溶液在34℃時(shí)已形成凝膠，故選擇此濃度為耳用熱敏型凝膠的基質(zhì)。

2.2 左氧氟沙星熱敏型凝膠體外釋藥的測(cè)定 根據(jù)相轉(zhuǎn)變溫度的檢測(cè)結(jié)果，選擇濃度為17%的P407左氧氟沙星溶液(3 g/L)進(jìn)行體外藥物累積釋放量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3.左氧氟沙星耳用熱敏型凝膠累計(jì)釋放曲線

結(jié)果表明:制備的左氧氟沙星耳用熱敏型凝膠在體外釋放過(guò)程中無(wú)突釋效應(yīng)，在160 h時(shí)的累積藥物釋放量已接近90%，釋藥基本完全，表明其具有較好的控釋性。將左氧氟沙星耳用熱敏型凝膠累計(jì)釋放曲線進(jìn)行零級(jí)釋藥曲線擬合，得方程 y=0.4798x+9.2214(r=0.9872)，結(jié)果符合方法學(xué)意義，即以等滲PBS為釋放介質(zhì)，左氧氟沙星耳用熱敏型凝膠釋放符合零級(jí)釋藥方程。

3 討論

目前化膿性中耳炎的主要治療方式［4］為全身和局部應(yīng)用抗菌藥物。全身應(yīng)用抗菌藥物的缺點(diǎn)是藥物達(dá)到患處的濃度較低，故需要的治療周期較長(zhǎng)，對(duì)機(jī)體其他組織的影響較大。傳統(tǒng)的局部應(yīng)用抗菌藥，如滴耳液，雖然克服了全身用藥對(duì)其他組織的影響，提高了患處局部藥物濃度，但是由于中耳的解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，藥物很容易從穿孔和咽鼓管流出，造成藥物在局部的作用時(shí)間短。雖然增加用藥次數(shù)可一定程度上維持局部藥物濃度，但給患者使用帶來(lái)不便。

化膿性中耳炎是由于細(xì)菌如葡萄球菌和肺炎鏈球菌等通過(guò)鼻咽管侵入中耳腔后感染，引起的中耳鼓室黏膜化膿性炎癥，其病理改變主要局限在中耳鼓室內(nèi)，我們認(rèn)為主要的治療方式是局部抗菌藥物的使用。但傳統(tǒng)用藥很難使抗菌藥物在局部保持較長(zhǎng)的作用時(shí)間，因此如何保持抗菌藥物在局部的長(zhǎng)時(shí)間作用一直是研究化膿性中耳炎治療的關(guān)鍵。理想中的制劑應(yīng)當(dāng)滿(mǎn)足2個(gè)條件:①較好的緩釋性，能長(zhǎng)期釋藥;②作用時(shí)間長(zhǎng)，在鼓室內(nèi)能夠長(zhǎng)時(shí)間滯留。故我們結(jié)合當(dāng)前藥劑學(xué)研究進(jìn)展，將熱敏型凝膠應(yīng)用于耳用藥物的制備。

熱敏型凝膠是一種環(huán)境敏感型凝膠，選用其中的P407作為左氧氟沙星熱敏型耳用凝膠的基質(zhì)，具有表面活性和良好的安全性［5］。相關(guān)研究［6］表明它還具有較好的控釋性及足夠的藥物攜帶量、良好的耐受性及易生物降解等優(yōu)點(diǎn)。我們對(duì)自備的左氧氟沙星耳用熱敏型凝膠體外釋藥進(jìn)行了測(cè)定，在160 h時(shí)累積藥物釋放量接近90%，釋藥基本完全，且釋放符合零級(jí)釋藥方程，故基本符合理想制劑的條件。

我們選用較為直觀簡(jiǎn)單的傾斜法來(lái)確定相轉(zhuǎn)變溫度，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)，最終確定以濃度為17%的P407溶液作為熱敏型凝膠的基質(zhì)。該濃度的P407相轉(zhuǎn)化溫度為34.4℃，最接近人體中耳內(nèi)鼓室的溫度。在體外釋放性能檢測(cè)中，我們驗(yàn)證了左氧氟沙星在紫外吸收光譜293 nm波長(zhǎng)處有最大的吸收光譜，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符;而選作釋放介質(zhì)的等滲PBS在293 nm波長(zhǎng)處吸收甚微，因此選定293 nm為測(cè)定左氧氟沙星熱敏型凝膠體外釋藥濃度的波長(zhǎng)有理論意義。研究凝膠類(lèi)藥物體外釋放，通?？刹捎昧⑹綌U(kuò)散池或者透析袋法。鑒于制備的左氧氟沙星耳用凝膠的特性，在能較好地模擬人體中耳環(huán)境的基礎(chǔ)上，采用立式Franz擴(kuò)散池來(lái)檢測(cè)凝膠藥物的釋放，穩(wěn)定性好、操作方便、測(cè)定準(zhǔn)確。

將P407作為左氧氟沙星的緩釋載體制成左氧氟沙星熱敏型凝膠，體外實(shí)驗(yàn)取得較好效果，但是否適合應(yīng)用于體內(nèi)尚未知。本課題組將做進(jìn)一步的研究，以期使之成為中耳炎治療的理想制劑。

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