戴 薇
(江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇 南京 210028)
清肝消痤顆粒[1,2]系江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方,由梔子、丹參、甘草等藥味組成,具有清肝利濕,化痰散結(jié)的功效。該方療效確切,為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)以方中的梔子苷、丹參素、甘草酸銨的含量為指標(biāo),采用多指標(biāo)評分法優(yōu)選清肝消痤顆粒的水提工藝,為制定該該制劑的合理提取工藝提供參考。
Waters高效液相色譜儀(Alliance 2695四元泵及自動進(jìn)樣系統(tǒng),996二極管陣列檢測,Empower色譜工作站);Millipore Milli-Q純水器;METTLER萬分之一及十萬分之一電子天平(瑞士)。
梔子、丹參等藥材均購自南京藥業(yè)股份有限公司中藥飲片廠,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室鑒定均為2010年中國藥典一部收載品種。梔子苷、丹參素、甘草酸銨對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號依次為:0749-200007、110855-200203、10731-200205),供含量測定用;重蒸水;甲醇、乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純。
2.1.1 浸泡條件優(yōu)選
按處方比例,稱取2副藥材,加10倍量水浸泡,每隔30min觀察一次,結(jié)果2h后所有藥材基本浸透,吸水量約2倍。因此藥材在煎煮之前先浸泡2h。
2.1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)
根據(jù)預(yù)試驗(yàn),對影響水提取工藝的主要因素:加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)按四因素三水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。各因素水平見表1。
表1 水提因素水平
2.1.3 正交試驗(yàn)樣品制備
按處方比例稱取梔子、丹參、甘草等藥材適量,分別按正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)安排進(jìn)行試驗(yàn),合并煎煮液,濾過,濾液濃縮定容至500mL。
2.1.4 含量測定
選擇2017年10月至2018年6月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院眼科檢查確診的NAION患者18例(18眼)作為NAION組。其中男8例,女10例。年齡38~78(60.5±10.6)歲,病程3.5~8.0(4.8±1.8)個(gè)月。
梔子苷[4-5]的含量測定如下所示:
(1)色譜條件:色譜柱:Alltima C18(5μm,4.6mm×250mm);流動相:乙腈-水(12:88);流速:1.0mL/min;檢測波長:240nm;柱溫:30℃。
(2)對照品溶液的制備:精密稱取梔子苷適量,加甲醇溶解制成每1mL含369.0μg的梔子苷對照品溶液。
(3)線性范圍考察:精密吸取梔子苷對照品溶液0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL,注入液相色譜儀,測定其峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),求得其回歸方程為:Y=1958169X-168000,r=0.9999。以上結(jié)果表明,在0.185~7.380μg/mL范圍內(nèi),梔子苷峰面積積分值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。
(4)精密度試驗(yàn):精密吸取對照品溶液(55.35μg·mL-1),連續(xù)進(jìn)樣5次,每次20μL,峰面積的RSD 0.1%(n=5)。
(5)供試品的制備:精密吸取樣品液1mL置25mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,過0.45μm的微孔濾膜,即得供試品液,注入高效液相色譜儀,見圖1,由峰面積計(jì)算含量,測定結(jié)果見表2。
圖1 樣品中的梔子苷色譜
丹參素的含量測定如下[6,7]:
(1)色譜條件:色譜柱:Alltima C18(5μm,4.6mm×250mm);流動相:乙腈-0.5%乙酸(3:97);流速:1.0mL/min;檢測波長:279nm;柱溫:35℃。
(2)對照品溶液的制備:精密稱取丹參素適量,加甲醇溶解制成每1mL含0.796mg的丹參素對照品溶液。
(3)線性范圍考察:精密吸取丹參素對照品溶液1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL,注入液相色譜儀,測定其峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),求得其回歸方程為:Y=4.75×105X-7.84×104,r=0.9999。以上結(jié)果表明,在0.796~15.920μg/mL范圍內(nèi),丹參素峰面積積分值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。
(4)精密度試驗(yàn):精密吸取對照品溶液(0.0998 mg·mL-1),連續(xù)進(jìn)樣5次,每次20μL,峰面積的 RSD 0.6%(n=5)。
(5)供試品的制備:精密吸取樣品液2mL置10mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,過0.45μm的微孔濾膜,即得供試品液,注入高效液相色譜儀,見圖1,由峰面積計(jì)算含量。測定結(jié)果見表2。
甘草酸銨[8,9]的含量測定:
(1)色譜條件:色譜柱:Alltima C18(5μm,4.6mm×250mm);流動相:乙腈-0.5%乙酸(37:63);流速:1.0 mL/min;檢測波長:250nm;柱溫:35℃。供試品的高效液相色譜圖見圖1。
(2)對照品溶液的制備:精密稱取甘草酸銨適量,加甲醇溶解制成每1mL含0.542mg的甘草酸銨對照品溶液。
(3)線性范圍考察:精密吸取甘草酸銨對照品溶液1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL,注入液相色譜儀,測定其峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),求得其回歸方程為:Y=6.72×105X-2.52×104,r=0.9999。以上結(jié)果表明,在0.542~10.84μg/mL范圍內(nèi),甘草酸銨峰面積積分值與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。
(4)精密度試驗(yàn):精密吸取對照品溶液(84.5 μg·mL-1),連續(xù)進(jìn)樣5次,每次20μL,峰面積的RSD 1.0%(n=5)。
(5)供試品的制備:精密吸取樣品液2mL置10mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,過0.45μm的微孔濾膜,即得供試品液,注入高效液相色譜儀,見圖1,由峰面積計(jì)算含量。測定結(jié)果見表2。
2.2.1 測定結(jié)果
將1~9號實(shí)驗(yàn)綜合評分進(jìn)行極差分析,結(jié)果見表2。
表2 水提正交試驗(yàn)及結(jié)果
2.2.2 方差分析結(jié)果
將1~9號實(shí)驗(yàn)綜合評分進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。
表3 方差分析結(jié)果
2.2.3 正交優(yōu)選結(jié)果
由表2可見,影響水煎煮效果的主要因素中,提取次數(shù)(C)對指標(biāo)成分的影響最大,加水量(A)次之,提取時(shí)間(B)影響最小。最優(yōu)水平組合為A3B3C3,即12倍量水煎煮3次,每次90min。由表3可見,提取次數(shù)(C)對指標(biāo)成分的提取有顯著影響,而加水量(A)、提取時(shí)間(B)無顯著影響。綜合表2、表3分析結(jié)果,本著節(jié)能增效的原則,確定煎煮工藝為:A2B2C3,即加10倍量水煎煮3次,每次60min。
按處方比例稱取梔子、丹參等藥材,分別按A3B3C3和A2B2C3優(yōu)選工藝條件進(jìn)行試驗(yàn),合并煎煮液,濾過,濾液濃縮定容至500mL。分別對指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定,結(jié)果如表4。
表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
由表4可見,我們確定的提取工藝A2B2C3與正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝A3B3C3對指標(biāo)成分的提取比較接近,而比正交試驗(yàn)中含量最高的一組試驗(yàn)略高,說明確定的工藝合理。
處方中梔子苷、丹參素和甘草酸銨的水溶性較好,故考慮用水提法對藥材進(jìn)行提取,考察了加水量、煎煮時(shí)間和提取次數(shù)提取率的影響,其中提取次數(shù)的影響較為顯著,結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中節(jié)約成本和時(shí)間的原則,選擇10倍量水煎煮3次,每次60min的提取工藝。
本實(shí)驗(yàn)采用HPLC對方中梔子苷、丹參素、甘草酸銨含量進(jìn)行測定,運(yùn)用多指標(biāo)綜合評分法對清肝消痤顆粒的水提方法進(jìn)行優(yōu)選,方中梔子為君藥,丹參和甘草為臣藥,根據(jù)三藥的主要成分在處方中的藥理作用確定其權(quán)重系數(shù)更有科學(xué)性和合理性,對工業(yè)生產(chǎn)可以起到積極的指導(dǎo)作用。
[1]鞠建明,錢大瑋,朱玲英,等.清肝消痤顆粒定性定量方法研究[J].中國新藥雜志,2006,15(1):44-46.
[2]鞠建明,錢大瑋,朱玲英,等.清肝消痤顆粒的精制工藝研究[J].中成藥,2006,28(6):899-901.
[3]蘇維輝,陳木水,任結(jié)梅.正交試驗(yàn)優(yōu)選無糖銀菊顆粒劑工藝[J].中藥材,2004,27(10):770-772.
[4]段啟,莊義修,陳華師.HPLC法測定不同產(chǎn)地梔子中梔子苷含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2009,5(6):20-21.
[5]陳偉康,方建和,丁銀平.RP-HPLC法測定清肝利膽膠囊中梔子苷[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,16(7):71-73.
[6]楊瑞芬,李素娟,樊文娟,等.RP-HPLC法測定丹參緩釋片中丹參素含量[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,10(1):34-36.
[7]鄭萍,謝笑天,孟東華,等.中藥丹參中丹參素、丹參酮A的提取及質(zhì)量研究[J].云南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,24(4):50-52.
[8]張國躍,痰飲丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2009,5(5):12-13.
[9]段天璇,于密密,劉春生,等.HPLC法同時(shí)測定甘草指紋圖譜暨甘草苷、甘草酸含量[J].中成藥,2006,28(2):161-165.