苯酚-硫酸法測定維吾爾藥核桃分心木多糖的含量

王 艷，茹仙古麗·哈斯木，韓艷春，阿孜古麗·伊明，阿依吐倫·斯馬義＊

（1.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊市中醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

核桃分心木（diaphragma juglandis fructus，簡稱分心木），別名胡桃衣、胡桃夾、胡桃隔，是胡桃科核桃屬植物核桃的果核內(nèi)木質(zhì)隔膜，呈薄片狀，多彎曲，體輕質(zhì)脆，易折斷［1］。分心木味苦、澀，性平；歸脾、腎經(jīng)。維吾爾醫(yī)常用分心木來治療腎虛遺精等疾病［2-4］。多糖為分心木主要有效成分之一。本研究采用苯酚-硫酸法對分心木提取液中的總多糖進(jìn)行含量測定，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究與指標(biāo)的制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為核桃分心木多糖的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料和試劑

核桃分心木（diaphragma juglandis fructus）采自新疆和田地區(qū)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布利孜教授鑒定為胡桃科核桃屬植物核桃的果核內(nèi)木質(zhì)隔膜。無水乙醇、正丁醇、氯仿、石油醚、95%乙醇、丙酮、乙醚（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，均為分析純），濃硫酸、重蒸苯酚（北京北細(xì)精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司，分析純），葡萄糖（天津市化學(xué)試劑三廠，分析純）；透析袋（MWCO：500）（上海綠島科技發(fā)展有限公司）等。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外光譜儀（島津）、EYELA SB-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）、AB104-N型多功能電子天平（Toledo Instr.Shanghai Ltd.）、SK2510HP超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲清洗儀有限公司）、Edwards Pirani 1001冷凍干燥器（U.K.）、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

2 方法與結(jié)果

2.1 核桃分心木粗多糖的制備

核桃分心木粉碎后，過100目篩，得核桃分心木粉末。稱取該粉末20.0g，用蒸餾水煎煮3次，分別為2h、2h、1.5h，合并煎煮液并適當(dāng)濃縮，先后用石油醚、95%乙醇萃取脫脂，余液濃縮至一定體積。采用Sevage法除蛋白，透析袋透析24h，然后將透析液按體積比1∶4加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇（使醇終濃度在75%～80%），置于冰箱中醇沉過夜，離心分離，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌1次，置于Edwards Pirani 1001冷凍干燥器中干燥，即得核桃分心木精制多糖。

2.2 核桃分心木多糖樣品溶液及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取干燥至恒重的核桃分心木15.8mg，以適量蒸餾水溶解，并定容至100mL，配制成濃度為0.158mg／mL的分心木多糖樣品溶液備用。

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖100mg（105℃），置于100mL的容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1mg／mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 不同濃度苯酚溶液的配制

稱取苯酚100g，加鋁粉0.1g和碳酸氫鈉0.05g，常壓蒸餾，收集182℃餾分。分別稱取該餾分3、4、5、6、7、8g，置于100mL的容量瓶中，并加新鮮蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，濾過至棕色瓶中，置冰箱中備用。

2.4 核桃分心木多糖的含量測定

2.4.1 顯色及測定條件的選擇

（1）最大吸收波長：分別吸取分心木多糖樣品溶液2.0mL、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.05mL，置于25mL的比色管中，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液以蒸餾水補(bǔ)充體積至2.0mL，然后分別加入5%的苯酚溶液1.0mL，搖勻，再滴加濃硫酸5.0mL，迅速振蕩搖勻，室溫下顯色30min，冰水混合物迅速冷卻。以2.0mL蒸餾水同上操作作為空白，采用UV-2550型可見-紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，掃描波長為400～700nm，掃描結(jié)果如圖1所示。根據(jù)圖1，核桃分心木多糖溶液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液均在（486±2）nm處有最大吸收峰，且吸收峰峰形相似，因此本實(shí)驗(yàn)確定486nm為最大吸收波長。酚溶液1.0mL，搖勻，再依次加入濃硫酸5.0mL，迅速振蕩搖勻，分別于室溫、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下顯色30min，冰水混合物迅速冷卻。以2.0mL蒸餾水同上操

圖1 核桃分心木多糖溶液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的掃描

（2）顯色溫度的選擇：吸取分心木多糖樣品溶液2.0 mL，分別置于不同編號的25mL具塞試管中，加入5%的苯作為空白，在最大波長486nm處，測定各分心木多糖樣品溶液的吸光值，結(jié)果見圖2。由圖2可知，分心木多糖溶液在不同溫度條件下放置顯色，其吸光度值在100℃時最大。故本實(shí)驗(yàn)采用100℃作為顯色溫度。

圖2 顯色溫度對吸光度的影響

（3）顯色時間的選擇：其他條件不變，按照“2.4.1（1）”和“2.4.2（2）”確定的最大吸收波長及最佳顯色溫度，只改變顯色時間（10、20、30、40、50、60min），分別測定其吸光值，結(jié)果見圖3。由圖3可知，其吸光度值在30min后趨于穩(wěn)定。因此，顯色時間采用30min為宜，各樣品溶液應(yīng)在60min內(nèi)測定完成。

圖3 顯色時間對吸光度的影響

（4）濃硫酸用量的選擇：其他條件不變，按照“2.4.1（1）”、“2.4.2（2）”及“2.4.3（3）”確定的最佳顯色及測定條件，只改變濃硫酸的用量（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0mL），分別測定其吸光值，結(jié)果見圖4。由圖4可知，濃硫酸加入量在5.0mL時水解最完全。

圖4 不同硫酸用量對吸光度的影響

（5）苯酚濃度的選擇：其他條件不變，按照“2.4.1（1）”、“2.4.2（2）”、“2.4.3（3）”及“2.4.3（4）”確定的最佳顯色及測定條件，只改變苯酚溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3%、4%、5%、6%、7%、8%），分別測定其吸光值，結(jié)果見圖5。由圖5可知，使用3%苯酚時，測得多糖溶液的吸光度值最大，故本實(shí)驗(yàn)中采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的苯酚溶液。

圖5 不同苯酚濃度對吸光度的影響

綜上所述，確定苯酚-硫酸法測定核桃分心木多糖的最佳條件為：取分心木多糖溶液2.0mL，加入3%的苯酚1.0mL，濃硫酸5.0mL，迅速振蕩搖勻，于100℃下顯色30min，在波長486nm處測定其吸光值。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取該葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4mL，均用蒸餾水補(bǔ)充至2.0mL。按照“2.4.1”確定的最佳顯色及測定條件測定各吸光度值，以2.0mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白。以葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A＝-0.0001+0.0389C，r＝0.9998，樣品檢測量在5.0～17.5μg／mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.4.3 換算因子的確定

精密稱取干燥至恒重的分心木多糖1.5mg，置于10mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻。分別取該樣品液6份，每份0.5mL于25mL比色管中，以蒸餾水補(bǔ)充至2.0mL，按照“2.4.1”確定的最佳顯色條件測定各吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試液中的葡萄糖含量，按下式計(jì)算出換算因子：f＝m／CD。其中，m為稱取的分心木多糖質(zhì)量（mg）；C為多糖液中葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg／mL）；D為多糖的稀釋倍數(shù)。測得f＝1.71，RSD＝1.07%（n＝6）。

2.4.4 多糖含量的測定

取多糖樣品溶液2.0mL，按照“2.4.1”確定的最佳顯色條件測定其吸光值，平行測定3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多糖液中葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并按下式計(jì)算樣品中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：多糖含量（% ）＝ （C×D×f／W）×100%。式中C為葡萄糖的濃度，D為供試液的稀釋因素，f為換算因子，W為核桃分心木的質(zhì)量。測得核桃分心木中多糖的含量為5.40%（n＝3）。

2.4.5 多糖含量測定方法驗(yàn)證

（1）精密度實(shí)驗(yàn)：取分心木多糖樣品液各2.0mL，按照“2.4.1”確定的最佳顯色條件測定其吸光值，1天內(nèi)測定6次?？季芏?，其RSD（n＝6）為0.1147%。

（2）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取分心木多糖樣品液2.0mL，按照“2.4.1”確定的最佳顯色條件顯色后，測定其吸光值在時間10、20、30、40、50、60min后的變化。其 RSD（n＝6）為0.2813%。

（3）重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：平行取分心木多糖樣品溶液2.0mL 6份，按照“2.4.1”確定的最佳顯色條件顯色，測定其吸光值，其RSD（n＝6）為.0085%。

（4）加樣回收率實(shí)驗(yàn)：分別取分心木多糖樣品溶液（15.8mg／mL）1.0mL，以蒸餾水分別稀釋至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，吸取稀釋后的多糖溶液各1.0mL，再分別加入0.05mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，然后以蒸餾水補(bǔ)充至2.0mL，按照“2.4.1”確定的最佳顯色條件進(jìn)行顯色并測定其吸光值，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

從“2.4.5”項(xiàng)下各實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，多糖樣品溶液在顯色后1h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定，測定結(jié)果的重現(xiàn)性好（RSD＝1.0%，＜3%），精密度高（RSD＝0.1%，＜5%），回收率較高（平均回收率為106.55%，RSD為5.18%）。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明，苯酚-濃硫酸法測定分心木中多糖的含量時，顯色反應(yīng)過程中需加熱。因?yàn)橄蚍中哪径嗵侨芤褐屑尤霛饬蛩岬倪^程雖是放熱反應(yīng)，但不能滿足顯色反應(yīng)的需要。

采用苯酚-濃硫酸法進(jìn)行多糖含量測定時，常使用葡萄糖［5，6］、阿拉伯糖［7］、葡聚糖［8，9］等作為標(biāo)準(zhǔn)品。其中，葡萄糖最為常用。但是天然藥物多糖的單糖組成較為復(fù)雜，且不同單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線各有差異［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用核桃分心木精制多糖進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，尤其是以精制多糖計(jì)算換算因子，一定程度上避免了用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品而引起的系統(tǒng)誤差。

多糖含量的測定方法主要有苯酚-濃硫酸法［10，11］、蒽酮-濃硫酸法［12］、咔唑-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸（簡稱DNS）法［13］、Fehling還原滴定法、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、薄層掃描法（TLCS）、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）［14］等。本研究采用苯酚-濃硫酸比色法測定核桃分心木中多糖的含量，多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚反應(yīng)生成橙黃色溶液，在波長486nm處有特征吸收。該方法的結(jié)果具有準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好、簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，可作為維吾爾藥核桃分心木中多糖含量測定的參考依據(jù)。

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