連翹提取物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞生成NO及表達(dá)iNOS的影響

王 耀，方 輝，高 萬(wàn)，侯建國(guó)，劉圓圓，趙 烽

（煙臺(tái)大學(xué) 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

連翹，又名旱蓮子（《藥性論》）、大翹子（《新修本草》），為木犀科植物連翹Forsythia suspensa Thunb.的干燥果實(shí)［1］。味苦微寒，歸肺、心、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效，主治癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風(fēng)熱感冒、溫病初起、溫?zé)崛霠I(yíng)、高熱煩渴、神昏發(fā)斑、熱淋尿閉［2］等。本文研究了連翹乙醇提取物對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)（NO、TNF-α）及一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表達(dá)的影響，以期探討連翹抗炎的相關(guān)機(jī)制。

1 材料

連翹（產(chǎn)地陜西）購(gòu)自煙臺(tái)生生堂藥房有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；LPS、MTT購(gòu)自Sigma公司；0.25%胰酶消化液、小鼠TNF-αELISA試劑盒為煙臺(tái)賽爾斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；anti-murine iNOS polyclonal antibody，COX-2（murine）polyclonal antibody購(gòu)自Cayman公司；β-actin antibody購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology，Inc。

2 方法

2.1 提取

將藥材放入1000mL的圓底燒瓶中，加8倍量70%乙醇，接上冷凝管，置于水浴中加熱回流提取2h。提取液抽濾，藥渣再加入6倍量70%乙醇加熱回流提取1h。合并2次提取液，減壓濃縮回收乙醇，得提取浸膏，干燥稱重。實(shí)驗(yàn)前以DMSO溶解配制成所需濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天傳代。

2.3 NO濃度測(cè)定及細(xì)胞生長(zhǎng)活性檢測(cè)

按照文獻(xiàn)［3］中所述的方法進(jìn)行測(cè)定。

2.4 ELISA法測(cè)定TNF-α濃度

取RAW 264.7細(xì)胞，以每毫升含5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板（每孔200μL），每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)1h后給藥，6h后收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α的濃度。

2.5 Western Blot法檢測(cè)iNOS、COX-2及內(nèi)參蛋白βactin表達(dá)水平

藥物干預(yù)24h后，棄去上清液，加入PBS清洗，細(xì)胞刮收集細(xì)胞，1000r·min-1離心3min，留細(xì)胞，繼續(xù)加入PBS，超聲破碎細(xì)胞，10000r·min-1離心5min，取上清用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，取等量蛋白行10%SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后室溫封閉1h，分別加入iNOS、COX-2、β-actin一抗溶液，4℃孵育過(guò)夜，洗膜；HRP標(biāo)記的二抗溶液室溫孵育1h，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，X光片顯影。

3 結(jié)果

3.1 連翹提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的抑制作用

空白組中NO濃度僅為2.59μmol·L-1，在1μg·mL-1的LPS刺激下，巨噬細(xì)胞釋放出大量的 NO（16.42 μmol·L-1），經(jīng)3～4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明兩組間有顯著性差異（P＜0.01），表明LPS能誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)NO。與LPS組相比，經(jīng)連翹提取物作用后，NO的含量明顯減少，呈現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 連翹對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的抑制作用

3.2 連翹提取物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響

連翹提取物在12.5～100μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的正常增殖均無(wú)明顯抑制作用，高濃度下（100μg·mL-1）作用24h后，給藥組細(xì)胞的存活率為100.28%，無(wú)細(xì)胞毒性。

3.3 連翹提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放TNF-α水平的影響

如表2所示，空白組中 TNF-α的濃度為73.11 pg·mL-1，經(jīng)LPS刺激6h后，細(xì)胞釋放大量的TNF-α，此時(shí)TNF-α的濃度為2745.67pg·mL-1，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.01）。連翹提取物可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放 TNF-α。

表2 連翹提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放TNF-α的抑制作用

3.4 連翹對(duì)iNOS、COX-2蛋白水平的影響

Western印跡結(jié)果表明，連翹提取物干預(yù)后iNOS蛋白水平明顯降低，而COX-2蛋白水平無(wú)明顯改變，見圖1。

圖1 連翹對(duì)iNOS、COX-2蛋白水平的影響

4 討論

NO是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化以L-精氨酸為底物生成的［4］，在機(jī)體的很多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，調(diào)節(jié)NO的生成及iNOS的表達(dá)被認(rèn)為是治療某些疾病的重要手段［5］。國(guó)內(nèi)外經(jīng)常把連翹和其它的中草藥配伍，制成復(fù)方制劑應(yīng)用于臨床，但其分子作用機(jī)理尚不十分清楚。本研究針對(duì)連翹提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO、TNF-α等炎癥因子的抑制作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明其能顯著抑制RAW 264.7細(xì)胞分泌NO和TNF-α，并且對(duì)iNOS蛋白表達(dá)水平也有抑制作用。由此可以明確連翹是通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞iNOS通路發(fā)揮抗炎作用。

［1］宋立人，洪恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：1041.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：117.

［3］趙凱華，趙烽，劉珂.腺梗豨薟提取物對(duì)脂多糖活化巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮的抑制作用［J］.煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)與工程版，2009，22（2）：137-140.

［4］ZAMBONI DS，RABINOVITCH M.Nitric oxide partially controls Coxiella burnetti PhaseⅡinfection in mouse primary macrophages［J］.Infect Immun，2003，7（1）：1225-1229.

［5］KLEINERT H，PAUTZ A，LINKER K，et al.Regulation of the expression of inducible nitric oxdie synthase［J］.Eur J Pharmacol，2004，500（13）：255-266.