葡萄球菌腸毒素DAS-ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

劉鵬翀，黃金海,*，劉 莉，劉 瑩，劉 壯，孫 盈

(1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2.天津市乳品食品監(jiān)測(cè)中心，天津 300381)

葡萄球菌腸毒素DAS-ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

劉鵬翀1，黃金海1,*，劉 莉1，劉 瑩1，劉 壯2，孫 盈1

(1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2.天津市乳品食品監(jiān)測(cè)中心，天津 300381)

為篩選特異性強(qiáng)、親和力高、可夾心配對(duì)單克隆抗體4A2和5C12，通過方陣試驗(yàn)優(yōu)化工作條件，建立金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)的雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定量檢測(cè)方法。結(jié)果表明：該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝4.074x－1.1888，R2＝0.9892，檢測(cè)下限為0.307μg/mL，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，脫脂乳粉中SEs摻入試驗(yàn)測(cè)定回收率為103%～107%，特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好；應(yīng)用所建雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，對(duì)數(shù)株葡萄球菌分離株體外培養(yǎng)上清中SEs產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析表明，不同菌株SEs分泌能力不同，且0～20h分泌量不斷增加，對(duì)鮮牛乳和豬淋巴組織勻漿中的SEs進(jìn)行檢測(cè)，檢出率分別為51.7%和59.1%，并與進(jìn)口商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，一致率達(dá)92.5%，表明食品中SEs污染的普遍存在。所建方法靈敏高效，可為食源性污染監(jiān)控提供有效手段。

葡萄球菌；葡萄球菌腸毒素；雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附法；檢測(cè)方法

葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)是由血漿凝固酶或耐熱核酸酶陽性菌株產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質(zhì)[1]。迄今，血清型鑒定明確的SEs除傳統(tǒng)分類的SEA、SEB、SEC、 SED、SEE、SEF(toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1)外， SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEM、SEN等新型腸毒素隨研究的深入而不斷被發(fā)現(xiàn)[2]。SEs已被認(rèn)為是第二大細(xì)菌毒素[3]，每100g食物中含有18μg既能引發(fā)中毒，是引起人類疾病和細(xì)菌性食物中毒的主要致病因子，為世界性衛(wèi)生問題[4]。建立食品原料中SEs的快速靈敏檢測(cè)方法對(duì)臨床診斷、預(yù)防SEs引起的食物中毒具有實(shí)際意義，也有助于開展對(duì)新型腸毒素蛋白結(jié)構(gòu)、功能等的理論研究。

目前，SEs檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附方法(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)仍是應(yīng)用最廣泛、可信度較高的方法，但目前普遍采用多抗，故具有存在交叉反應(yīng)、靈敏度不足等缺陷，使得SEs的檢測(cè)難于定量，不能滿足新型腸毒素檢測(cè)的需求。本研究通過篩選特異性強(qiáng)、親和力高、可夾心配對(duì)的單抗，建立雙抗體夾心(double antibody sandwich，DAS)-ELISA定量檢測(cè)SEs方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豬淋巴組織勻漿樣本110份，采集于天津市屠宰場，－40℃凍存；鮮牛乳樣本120份，由天津市乳品監(jiān)測(cè)中心提供。

SEA抗原標(biāo)準(zhǔn)品 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物學(xué)研究所；SEA-His、SEK-His、SEO-His、SEG-His、SEUHis重組抗原、抗SEA單克隆抗體 4A2、7G5，抗SEO單克隆抗體8C7、5C12腹水 自制；葡萄球菌分離株P(guān)MJ 28-1(sea)、JIN 2(sek)、PMJ24-3(seo)、PYN1-3 (seg、sem、sen、seo)、ZNZ2-3(攜帶腸毒素sea、sec、sed、tsst、seg、she、sei、sem、sen、ser、seu基因)、JI 1-1(未攜帶腸毒素基因)(括號(hào)內(nèi)為菌株攜帶腸毒素基因)由本實(shí)驗(yàn)室保存；金黃色葡萄球菌腸毒素總量檢測(cè)試劑盒(RIDASCREEN SET Total) 德國R-Biopharm公司。其余常規(guī)試劑均為分析純。

96孔酶標(biāo)板 美國Costa公司；DNM-9602酶標(biāo)儀北京普朗新技術(shù)公司；Fossomatic 5000體細(xì)胞分析儀 北京福斯佳科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單克隆抗體的制備與標(biāo)記

飽和硫酸銨法分別純化4A2、7G5、8C7和5C12腹水，紫外吸收法測(cè)定蛋白濃度。間接ELISA法測(cè)定純化抗體效價(jià)，按Beatty推導(dǎo)公式計(jì)算相對(duì)抗體親和力[5]。選取效價(jià)高、親和力較強(qiáng)的單抗，Wilson改良過碘酸鈉法進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記。標(biāo)記物(HRP-McAb)采用直接ELISA方法進(jìn)行抗體活性鑒定。

1.2.2 DAS-ELISA方法的建立

將除HRP標(biāo)記用抗體外的其余株單抗作1:100稀釋包被，分別與HRP標(biāo)記單抗進(jìn)行配伍組合，以選擇最佳夾心配對(duì)抗體。再將最佳包被抗體分別作1:50、1:100、1:200、1:400稀釋包被，SEA-His重組蛋白作為抗原，并按1:40、1:80、1:160、1:320稀釋進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用交叉方陣滴定法[6]，篩選、確定包被抗體與抗原最佳工作質(zhì)量濃度；同時(shí)對(duì)封閉液種類和質(zhì)量濃度、酶標(biāo)抗體工作質(zhì)量濃度、顯色時(shí)間等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的檢測(cè)體系。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

按照已確定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA檢測(cè)，以SEA純品及SEA-His為陽性樣品，從10μg/mL起進(jìn)行“2×”倍比稀釋至0.078μg/mL，各組重復(fù)3孔。分別以O(shè)D450值為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)抗原質(zhì)量濃度的常用對(duì)數(shù)(lg CSEs)為縱坐標(biāo)，獲得線性區(qū)段標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并計(jì)算天然腸毒素檢測(cè)下限。在線性檢測(cè)范圍為內(nèi)分別將SEA-His、SEK-His、SEO-His、SEG-His、SEU-His進(jìn)行“2×”倍比稀釋，繪制回歸曲線。

1.2.4 特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

大腸埃希氏菌腸毒素為食品常見污染物，將大腸埃希氏菌LB過夜培養(yǎng)物12000r/min離心2min取上清液，應(yīng)用DAS-ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)設(shè)檢測(cè)質(zhì)量濃度為5、2.5、1.25μg/mL的SEA-His陽性、空白培養(yǎng)基陰性對(duì)照。每組重復(fù)12孔，t檢驗(yàn)分析所建立方法的特異性及批內(nèi)變異系數(shù)。將制備的不同批次的酶標(biāo)板于4℃放置1、3、7、10d后，檢測(cè)同一SEA-His陽性樣品，每組重復(fù)12孔，計(jì)算批間變異系數(shù)。

1.2.5 DAS-ELISA方法檢測(cè)樣品中腸毒素

6株葡萄球菌分離株天然SEs分泌的動(dòng)力學(xué)分析：將不同葡萄球菌分離株單菌落分別接種10mL LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)(120r/min)12h，獲得種子液。分別取種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種50mL腦心浸液培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)(120r/min)20h。發(fā)酵過程中，0～9h內(nèi)每小時(shí)取樣1mL，10～20h每2h取樣1mL，樣本于4℃、12000r/mim離心5min，留取上清液，即為天然SEs粗提取液。利用DASELISA體系檢測(cè)6種葡萄球菌產(chǎn)毒動(dòng)態(tài)變化。

鮮牛乳、豬肉組織中SEs檢測(cè)：稱取5g SEs檢測(cè)陰性脫脂乳粉溶于95mL蒸餾水配制成5%脫脂乳液，煮沸30min后分別加入高(20μg/mL)、中(5μg/mL)、低(1.25μg/mL)不同劑量的SEA-His，混合后12000r/min離心2min，取上清液，按建立檢測(cè)程序測(cè)定，計(jì)算平均回收率。采集天津地區(qū)120份鮮牛乳，應(yīng)用體細(xì)胞分析儀測(cè)定體細(xì)胞數(shù)，同時(shí)取1mL樣品12000r/min離心2min，取水相上清作待測(cè)樣品。采集天津地區(qū)110份豬肉淋巴結(jié)，分別稱取1g組織樣本，加入5mL PBS勻漿后4℃、12000r/min離心5min，取上清液作待測(cè)樣品。采用DASELISA方法對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測(cè)，并隨機(jī)抽取40份樣品應(yīng)用RIDASCREEN SET Total試劑盒檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆抗體純化與標(biāo)記

4A2、7G5、8C7和5C12四株純化單抗含量分別為4.50、8.92、9.25、6.27mg/mL，效價(jià)為1:5120～1:10240，相對(duì)親和常數(shù)均大于6.612×108L/mol。選用效價(jià)及抗原結(jié)合能力相對(duì)較佳的5C12株單抗對(duì)其進(jìn)行HRP標(biāo)記，結(jié)合率為0.831。經(jīng)直接ELISA測(cè)定，HRP-5C12在1:6400稀釋時(shí)，結(jié)果仍為陽性。

2.2 DAS-ELISA方法建立及優(yōu)化

分別以4A2、7G5、8C7純化抗體作為捕獲抗體，HRP-5C12作為檢測(cè)抗體，進(jìn)行夾心配對(duì)。選取P/N值最高且本底值較低的配對(duì)為最佳配伍組合(圖1)。

圖1 3株單抗夾心配對(duì)結(jié)果Fig.1 Results of sandwich matching for three McAbs

確立DAS-ELISA方法最佳工作條件為：4A2株單抗稀釋至4.5、100μL/孔，4℃過夜包被；體積分?jǐn)?shù)5%豬血清為封閉液；HRP-5C12工作濃度1:160。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

圖2 SEA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of SEA

應(yīng)用確定的DAS-ELISA反應(yīng)程序檢測(cè)SEA-His系列稀釋樣品，繪制腸毒素質(zhì)量濃度常用對(duì)數(shù)與OD值之間的反應(yīng)回歸曲線，結(jié)果見圖2，結(jié)果表明SEA-His在0.312～10μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，DASELISA檢測(cè)OD450(x)與腸毒素含量常用對(duì)數(shù)lg CSEA(y)之間的回歸方程為y＝4.074x－1.1888，R2＝0.9892，計(jì)算可知所建方法對(duì)天然腸毒素檢測(cè)下限為0.307μg/mL。

在0.307～10μg/mL檢測(cè)線性范圍內(nèi)，分別檢測(cè)SEAHis、SEK-His、SEO-His、SEG-His、SEU-His倍比稀釋樣品，結(jié)果見圖3。5種SEs-His及天然腸毒素SEA回歸曲線線性關(guān)系良好，斜率相近，表明選用SEA-His建立的DAS-ELISA方法識(shí)別天然腸毒素SEA外，同時(shí)能夠檢測(cè)包括SEG、SEK、SEO、SEU在內(nèi)多種血清型腸毒素，所用單抗具備群特異性，能滿足食品中多型SEs檢測(cè)的要求。

圖3 SEs-His及SEA回歸曲線Fig.3 Comparison of the regression curves of SE-His and SEA

2.4 特異性、重復(fù)性與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

同時(shí)檢測(cè)大腸埃希氏菌培養(yǎng)上清液及空白培養(yǎng)基，OD450分別為0.102±0.009、0.096±0.011，t檢驗(yàn)(P＞0.05)，表明檢測(cè)方法與大腸埃希氏菌培養(yǎng)物無交叉反應(yīng)。對(duì)不同含量SEs樣品檢測(cè)的批內(nèi)變異系數(shù)在2.319%～3.746%、不同批次檢測(cè)試劑盒對(duì)相同樣品檢測(cè)的批間變異系數(shù)為6.140%～10.251%，表明檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5 DAS-ELISA方法的初步應(yīng)用

模擬葡萄球菌產(chǎn)生SEs培養(yǎng)環(huán)境，應(yīng)用建立的DASELISA體系檢測(cè)6株葡萄球菌腸毒素產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)變化，分別以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD450為縱坐標(biāo)，繪制動(dòng)態(tài)曲線如圖4所示。結(jié)果表明，不同菌種產(chǎn)毒能力不同，除菌株JI1-1培養(yǎng)20h時(shí)接近陰陽性臨界值，其余菌株在此培養(yǎng)條件下6～8h均有天然腸毒素檢出，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長遞增趨勢(shì)明顯。

圖4 6株葡萄球菌SEs分泌動(dòng)態(tài)曲線Fig.4 Dynamic curves of SE secretion by different isolates

檢測(cè)添加不同劑量SEA-His脫脂乳中毒素，實(shí)測(cè)值與理論值間符合率良好，回收率接近100%。表1所示，SEs具有良好的親水性，離心處理不影響奶樣中SEs的全量檢出。

表1 脫脂乳腸毒素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery rates of DAS-ELISA for milk samples spiked with ES

對(duì)120份鮮牛乳樣品中SEs進(jìn)行檢測(cè)(表2)，陽性檢出率為51.7%。與體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)結(jié)果比較，其中體細(xì)胞數(shù)超標(biāo)(＞5×10個(gè)/mL)且SEs陽性檢出的樣品55份，體細(xì)胞數(shù)正常且SEs陰性檢出的樣品28份，附合率達(dá)69.7%(83/120)，表明SEs陽性與其體細(xì)胞超標(biāo)可能存在一定相關(guān)性。110份豬淋巴結(jié)中SEs檢測(cè)結(jié)果(表3)顯示，腸毒素在淋巴結(jié)中有較高的檢出率59.1%。隨機(jī)抽取40份樣品，自建DAS-ELISA方法與RIDASCREEN SET Total試劑盒檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，一致率為92.5%。

表2 天津地區(qū)120份生鮮牛乳樣本中腸毒素檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of ES in 20 fresh milk samples by DAS ELISA

表3 天津地區(qū)110份豬淋巴組織樣品中腸毒素檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of ES in porcine lymphoid tissue samples by DAS-ELISA

3 討 論

葡萄球菌腸毒素對(duì)食品安全和人類健康有嚴(yán)重影響，基因水平的研究表明多種新型SEs 的存在[7]，建立應(yīng)用于食品及臨床樣品中SEs的特異、敏感、快速、分型檢測(cè)方法具有重要意義。由于不同SEs血清型間氨基酸序列高度同源性等因素[8]，難以獲得型特異性抗體用于檢測(cè)，使得定性、定量以及分型檢測(cè)成為研究難點(diǎn)[9]。

本研究所建立DAS-ELISA具有以下特點(diǎn)：檢測(cè)體系選擇了可識(shí)別SEA、SEO、SEQ、SEU、SEK、SEG等多種腸毒素的群特異性單克隆抗體分別作為包被與檢測(cè)抗體，可用于多種SEs的檢出；所選單抗特異性強(qiáng)、親和力高、可夾心配對(duì)，避免了選擇多抗中多組分復(fù)雜性引起的交叉反應(yīng)、內(nèi)源性過氧化物干擾、本底值偏高等問題，能滿足復(fù)雜食品原料中腸毒素檢測(cè)的要求；可實(shí)現(xiàn)SEA及多種新型腸毒素的定量檢測(cè)，特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，在0.312～10μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性相關(guān)，該方法檢測(cè)下限僅為0.307μg/mL，低于基于高效價(jià)多抗基礎(chǔ)上的檢測(cè)限為1ng/mL的ELISA方法[10-11]。且單抗強(qiáng)的特異性、低交叉反應(yīng)、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，更適合于檢測(cè)試劑盒的研制，通過生物素(B)-親和素(A)等生物放大系統(tǒng)可進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。

所建DAS-ELISA方法，可檢測(cè)模擬食品環(huán)境的培養(yǎng)基質(zhì)中天然SEs產(chǎn)生的變化情況，分析其分泌規(guī)律。對(duì)天津地區(qū)部分養(yǎng)殖條件較差的個(gè)體養(yǎng)殖場鮮牛乳樣品及豬肉淋巴結(jié)組織中的SEs檢測(cè)表明，奶、肉中存在較高的SEs檢出率(陽性檢出率分別為51.7%和59.1%)，且相當(dāng)數(shù)量陽性樣品接近或超過中毒劑量。葡萄球菌是動(dòng)物性食品原料保藏及加工等過程中極易污染的細(xì)菌，其產(chǎn)生的SEs具有超抗原活性容易導(dǎo)致機(jī)體的免疫紊亂，加之其耐高溫高壓等特性，使其安全風(fēng)險(xiǎn)倍增[12]。隨著我國膳食結(jié)構(gòu)的變化，動(dòng)物性食品原料所占比例的提高，SEs中毒給食品安全帶來新挑戰(zhàn)。但目前國內(nèi)除部分進(jìn)口嬰幼兒乳粉進(jìn)行產(chǎn)SEs檢測(cè)外，其他乳制品、肉制品加工及出售前僅進(jìn)行葡萄球菌的檢測(cè)。制訂奶、肉等動(dòng)物性食品中SEs的相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，加強(qiáng)其控制及監(jiān)管，將對(duì)防止食源性中毒的發(fā)生具有重要意義。

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Development and Application of DAS-ELISA for Detection of Staphylococcal Enterotoxin

LIU Peng-chong1，HUANG Jin-hai1,*，LIU Li1，LIU Ying1，LIU Zhuang2，SUN Ying1
(1. School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China；

2. Dairy Food Monitoring Center of Tianjin City, Tianjin 300381, China)

Staphylococcal enterotoxin (SE) is an important pathogenic factor for human food-borne diseases. Based on a couple of monoclonal antibodies with high sensitivity and affinity, a rapid, sensitive, specific DAS-ELISA method for the quantitative detection of SE was established. The linear regression equation was y＝4.074x－1.1888 (R2＝0.9892). The detection limit was 0.307 μg/mL. The average recovery rates for SE in skim milk powder were 103%－107% with relative standard deviation (RSD) of less than 10%. In addition, the method was also successfully used for monitoring the dynamic change of SE secretion in culture supernatants of Staphylococcus aureus isolates, indicating that it can be used not only for the detection of enterotoxin-producing strains but also for monitoring the secretion of SE. Moreover, the positive rates of the method for the detection of SE in fresh milk and porcine lymphoid samples were 51.7% and 59.1%, respectively. The total coincidence rate between the results obtained by the method and imported kit was 92.5%. Therefore, the method was sensitive and efficient and could provide an effective technical support for monitoring food-borne pollution.

Staphylococcus aureus；staphylococcal enterotoxin；double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(DAS-ELISA)；detection method

R378.11

A

1002-6630(2012)08-0195-04

2011-04-02

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(08JCZDJC22600)

劉鵬翀(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：lpc_liupengchong@126.com

*通信作者：黃金海(1970—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锕こ?。E-mail：jinhaih@163.com