肉桂原花青素的提取及其對(duì)高級(jí)糖基化終產(chǎn)物形成的抑制作用

黎 超，毛超倫，雍克嵐*

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444)

肉桂原花青素的提取及其對(duì)高級(jí)糖基化終產(chǎn)物形成的抑制作用

黎 超，毛超倫，雍克嵐*

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444)

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定肉桂中原花青素(proanthocyanidins of cinnamon，CPAs)最佳水提工藝條件，比較9種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)CPAs的吸附與解吸性能，對(duì)CPAs進(jìn)行體外蛋白非酶糖化抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：最佳提取條件為液料比14:1(mL/g)、提取溫度60℃、pH5.0、提取時(shí)間2h，CPAs提取得率為14.27mg/g，LSA-21大孔吸附樹(shù)脂分離純化CPAs效果最佳。該肉桂提取物對(duì)高級(jí)糖基化終產(chǎn)物的形成具有很好的抑制活性，其IC50為45.93 μg/mL，高于陽(yáng)性對(duì)照氨基胍。

肉桂；原花青素；大孔樹(shù)脂；高級(jí)糖基化終產(chǎn)物

肉桂為樟科樟屬常綠喬木肉桂的干燥樹(shù)皮，是一種藥食兩用植物資源。肉桂原花青素含量豐富，居98種常見(jiàn)食物原料之首[1]，高于葡萄籽。原花青素是由兒茶素或表兒茶素通過(guò)C4－C6或C4－C8聚合而成的一大類酚類聚合物，是一類植物體次級(jí)代謝產(chǎn)物，因其顯著的抗氧化、清除自由基性質(zhì)而對(duì)心血管疾病的預(yù)防以及增強(qiáng)免疫、抗炎、抗癌等具有較好作用[2]。我國(guó)肉桂產(chǎn)量占世界的80%以上[3]，因此從肉桂中提取原花青素具有很好的前景。

高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)是指還原糖與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸的氨基基團(tuán)發(fā)生非酶促反應(yīng)形成的一類復(fù)雜的不可逆聚合物[4]?，F(xiàn)代研究證實(shí)AGEs在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，AGEs在體內(nèi)的蓄積能誘發(fā)糖尿病腎病、白內(nèi)障、神經(jīng)病變[5-6]以及動(dòng)脈硬化[7]和Alzheimer,s病[8-9]等。這些嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者致殘、致死的主要原因。因此篩選開(kāi)發(fā)AGEs形成的抑制劑，對(duì)于預(yù)防和治療糖尿病并發(fā)癥，有重要意義。

迄今為止，關(guān)于肉桂抗AGEs形成的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)肉桂原花青素提取工藝優(yōu)化及其抗AGES形成抑制活性進(jìn)行研究，為肉桂的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂 廣東省高要市；(+)-兒茶素(含量≥99%) 中國(guó)藥品生物制品檢定所；氨基胍鹽酸鹽 美國(guó)Sigma公司；NaN3美國(guó)Ameresco公司；牛血清白蛋白(BSA)北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；AB-8、ADS-17、ADS-21大孔樹(shù)脂 天津南開(kāi)和成科技有限公司；D-101、LSA-10、LSA-21、LSA-40、XDA-1大孔樹(shù)脂 西安藍(lán)曉科技有限公司；HP-20樹(shù)脂 日本三菱化學(xué)公司。其他化學(xué)試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

LS-55型熒光分光光度計(jì) 美國(guó)PerkinElmer公司；Cary 100型紫外-可見(jiàn)分光光度儀 美國(guó)Varian公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)尼高利儀器公司；SPX-150B型生化培養(yǎng)箱 上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；EYELA N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本東京理化株式會(huì)社；ALPHA2-4型凍干機(jī) 德國(guó)Christ公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市富華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉桂原花青素的提取工藝

肉桂→粉碎→熱水浸提→抽濾→濾液濃縮→醇沉→離心分離→上清液→濃縮除醇→凍干即得CPAs

操作要點(diǎn)：以3g肉桂為原料，經(jīng)粉碎后，以水為溶劑，用醋酸鹽緩沖液調(diào)pH值，加熱提取，經(jīng)過(guò)濾、濾液濃縮、3倍體積乙醇過(guò)夜沉淀、離心分離、減壓濃縮、凍干等步驟得到粗原花青素。

1.3.2 原花青素含量檢測(cè)

采用香草醛-濃鹽酸[10]法，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y＝0.0035x－0.0359，R2＝0.9995，其中y為吸光度，x為(+)-兒茶素質(zhì)量濃度/(μg/mL)，線性質(zhì)量濃度范圍為50～250μg/mL。取肉桂提取凍干樣，溶解稀釋到一定體積V/mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算原花青素含量C/(μg/mL)。按下式計(jì)算原花青素得率：

式中：M提取物為肉桂提取凍干樣質(zhì)量/mg；M原料為肉桂原料質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素與正交試驗(yàn)

選擇提取溫度、液料比、提取時(shí)間、pH值等單因素進(jìn)行試驗(yàn)，在單因素經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇液料比、提取溫度和提取時(shí)間為考察因素，每個(gè)因素?cái)M定3個(gè)水平，選用L9(33)正交試驗(yàn)表，以原花青素得率作為考核指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)篩選最佳水提工藝條件，因素水平見(jiàn)表1。

表1 肉桂原花青素的提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.3.4 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸

稱取經(jīng)預(yù)處理的干樹(shù)脂2g于100mL具塞三角瓶中，加入肉桂水提稀釋液70mL，室溫振蕩(100r/min)5h，至吸附平衡，過(guò)濾，取上清液測(cè)定原花青素含量，計(jì)算吸附率。靜態(tài)吸附完畢，抽濾后用純凈水洗淋。把樹(shù)脂轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入20mL 70%乙醇溶液，室溫100r/min振蕩5h，取上清液，測(cè)定原花青素含量，計(jì)算解吸率。

1.3.5 體外蛋白非酶糖化抑制測(cè)定[11]

在pH7.4 PBS緩沖液中加入葡萄糖、BSA、NaN3，使其終質(zhì)量濃度分別為500mmol/L、50mg/mL和0.2g/L，完全溶解后分裝入具塞試管中(每管5mL)；加入待測(cè)樣品(0.1mg/mL)，氨基胍為陽(yáng)性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)不加試樣的空白對(duì)照。

各組反應(yīng)液置37℃避光密封孵育，7d及30d后，用熒光分光光度儀對(duì)空白對(duì)照組進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的預(yù)掃描，所得最大吸收值時(shí)對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)即為最佳測(cè)試條件。在該條件下檢測(cè)各組的熒光強(qiáng)度值F。計(jì)算肉桂原花青素對(duì)AGEs形成的抑制率：

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂原花青素提取工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1 浸提溫度對(duì)原花青素得率的影響

在為液料比10:1、浸提時(shí)間1.5h、pH6.0條件下，不同提取溫度對(duì)肉桂原花青素得率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著浸提溫度的升高，肉桂原花青素得率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)浸提溫度達(dá)到60℃后上升變化較為緩慢，從節(jié)約能源和提高得率的角度考慮，確定浸提溫度以60℃為宜。

圖1 浸提溫度對(duì)原花青素得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of CPAs

2.1.2 液料比對(duì)原花青素提取率的影響

在浸提溫度60℃、浸提時(shí)間1.5h、pH6.0的條件下，不同液料比對(duì)肉桂原花青素得率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，肉桂原花青素得率隨著溶劑量的增加而增加，當(dāng)液料比達(dá)到14:1后上升變化較為緩慢，所以確定浸提的液料比以14:1為宜。

圖2 液料比對(duì)原花青素得率的影響Fig.2 Effect of liquid/solid ratio on extraction rate of CPAs

2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響

在浸提溫度60℃、液料比14:1、pH6.0條件下，不同浸提時(shí)間對(duì)肉桂原花青素得率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，浸提2.5h左右效果最好，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)肉桂原花青素提取效果反而不好，所以浸提時(shí)間選擇2.5h為宜。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of CPAs

2.1.4 浸提液pH值對(duì)原花青素提取率的影響

在浸提溫度60℃、液料比14:1、浸提時(shí)間2h條件下，不同提pH值浸提對(duì)肉桂原花青素得率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著pH值的升高，肉桂原花青素得率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)pH值達(dá)到6后下降明顯，確定浸提pH值以5為宜。

圖4 浸提液pH值對(duì)原花青素得率的影響Fig.4 Effect of pH on extraction rate of CPAs

2.2 正交試驗(yàn)

分析結(jié)果表明，3種考察因素對(duì)CPAs提取率影響的大小順序?yàn)锽＞C＞A，即液料比＞浸提時(shí)間＞浸提溫度。液料比太小，提取不完全；提取時(shí)間太長(zhǎng)，得率下降；原花青素在高溫下具有熱不穩(wěn)定性，易聚合形成高聚體的鞣質(zhì)。所以其適宜提取工藝條件：浸提溫度60℃、液料比14:1、浸提時(shí)間2h、pH5.0，此工藝條件下原花青素得率為14.27mg/g。

表2 肉桂原花青素提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析表Table 2 Results of orthogonal tests and range analysis

2.3 大孔樹(shù)脂純化試驗(yàn)

通過(guò)9種大孔吸附樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HP-20、D-101、LSA-21樹(shù)脂對(duì)肉桂原花青素的吸附性能較好；ADS-21、LSA-21、LSA-40樹(shù)脂的解吸性能較好。結(jié)合樹(shù)脂價(jià)格綜合考慮，確定選用LSA-21樹(shù)脂對(duì)肉桂水提原花青素進(jìn)行純化。肉桂水提物經(jīng)LSA-21樹(shù)脂純化后原花青素含量達(dá)75%。

表3 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Static adsorption and desorption performance of macro-porous resins

2.4 肉桂原花青素對(duì)AGEs形成的影響

2.4.1 AGEs熒光光譜掃描

設(shè)定發(fā)射波長(zhǎng)450 nm，激發(fā)波長(zhǎng)范圍為20 0～440nm，激發(fā)狹縫4nm，發(fā)射狹縫4nm，掃描步長(zhǎng)5nm，掃描速度500nm/min，掃描圖見(jiàn)圖5。

圖5 AGEs的熒光光譜等高線圖Fig.5 Fluorescence contour spectra of AGEs

由圖5可知，在λEx＝380nm，λEm＝450nm處有最高熒光峰，因此本實(shí)驗(yàn)選擇λEx＝380nm，λEm＝450nm，激發(fā)狹縫＝4nm，發(fā)射狹縫＝4nm，發(fā)射光濾光片＝390nm(Cut-off)作為AGEs測(cè)定參數(shù)。

2.4.2 肉桂原花青素對(duì)AGEs形成的抑制作用

氨基胍是一種親核肼類小分子化合物，是目前比較公認(rèn)的AGEs形成抑制劑。作用機(jī)制主要是氨基胍能捕獲非酶糖化中間產(chǎn)物如甲基乙二醛(MGO)、乙二醛(GO)和3-脫氧葡糖糖醛酮(3-DG)等反應(yīng)性羰基化合物，形成無(wú)生物毒性的加合物，從而抑制AGEs形成。但由于其在美國(guó)和加拿大等國(guó)進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著副作用[4]，而最終沒(méi)得以商業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用。由不同濃度CPAs在孵育第30天時(shí)對(duì)AGEs形成的抑制率計(jì)算得其IC50為45.93μg/mL，高于陽(yáng)性對(duì)照氨基胍的92.30μg/mL。同時(shí)對(duì)比圖6可知，CPAs在非酶糖化反應(yīng)孵育7d(AGEs形成的早期)就顯示出顯著抑制作用，而同時(shí)期氨基胍抑制效果較差，表明CPAs的抑制機(jī)制有別于氨基胍。關(guān)于原花青素抑制糖基化反應(yīng)的作用機(jī)理，經(jīng)初步分析認(rèn)為原花青素為多酚物質(zhì)，具有較強(qiáng)抗氧化活性，能清除還原性羰基化合物，同時(shí)原花青素屬縮合單寧，它能在非酶糖化反應(yīng)前與相關(guān)蛋白結(jié)合從而阻止AGEs的形成。

圖6 肉桂原花青素(A)和氨基胍(B)對(duì)AGEs形成的抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of CPAs and aminoguanidimine (positive control) on AGEs formation

2.5 肉桂原花青素的定性鑒定

原花青素本身無(wú)色，在熱酸條件下降解、氧化可產(chǎn)生深紅色花色素離子，反應(yīng)后溶液為深紅色，則表明發(fā)生了花色素反應(yīng)，其產(chǎn)物在546nm處有強(qiáng)吸收。本實(shí)驗(yàn)取大孔樹(shù)脂純化后的凍干粉末經(jīng)正丁醇-鹽酸分析呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，表明粉末中有原花青素存在。肉桂提取物凍干粉經(jīng)紫外可見(jiàn)及紅外光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖7、8。

圖7 CPAs 的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.7 UV-visible spectrum of CPAs

圖8 CPAs 的紅外光譜圖Fig.8 IR spectrum of CPAs

紫外可見(jiàn)掃描表明CPAs在280nm處有唯一吸收峰，紅外掃描圖譜表明含多羥基及苯環(huán)，與原花青素結(jié)構(gòu)特征相符。

3 結(jié) 論

肉桂在浸提溫度60℃、液料比14:1、浸提時(shí)間2h、pH5.0條件下水提，原花青素得率為14.27mg/g。LSA-21樹(shù)脂對(duì)肉桂原花青素具有較好的吸附與解吸性能，經(jīng)其純化后原花青素含量可達(dá)75%。

肉桂原花青素對(duì)體外蛋白非酶糖化具有顯著抑制作用，其IC50為45.93μg/mL，高于陽(yáng)性對(duì)照氨基胍，且有別于氨基胍能對(duì)非酶糖化早期反應(yīng)進(jìn)行抑制。提示肉桂對(duì)于糖尿病并發(fā)癥也具有潛在的防治作用。

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Water Extraction of Cinnamon Proanthocyanidins and Its Inhibitory Effect on the Formation of Advanced Glycation End Products

LI Chao，MAO Chao-lun，YONG Ke-lan*
(School of Life Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

One factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to determine the optimal operating conditions for water extraction of proanthocyanidins from cinnamon (CPAs). Nine types of macroporous adsorption resin were compared for their effectiveness in adsorbing and desorbing CPAs. Meanwhile, the in vitro inhibitory effect of CPAs on the formation of advanced glycation end products (AGEs) was tested. The optimal extraction conditions were found to be 2 h of extraction at 60 ℃with acidic water at pH 5.0 (adjusted with sodium acetate-acetic acid buffe) at a liquid/solid ratio of 14:1 (mL/g). Under these conditions, the extraction rate of CPAs was 14.27 mg/g. LSA-21 resin was the most effective in purifying CPAs. CPAs had strong inhibitory activity on the formation of AGEs with an IC50 of 45.93μg/mL, which was higher than that of the positive control aminoguanidimine.

cinnamon；proanthocyanidins；macroporous resin；advanced glycation end products

TS201.1

A

1002-6630(2012)08-0126-05

2011-03-25

黎超(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：jackylc@shu.edu.cn

*通信作者：雍克嵐(1947—)，女，教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用。E-mail：klyong@staff.shu.edu.cn