海參腸乙酰膽堿酯酶親和層析洗脫條件的優(yōu)化

杜 英，朱蓓薇，吳海濤*

(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034)

海參腸乙酰膽堿酯酶親和層析洗脫條件的優(yōu)化

杜 英，朱蓓薇，吳海濤*

(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034)

以3-羧基苯基-乙基二甲基銨為配基，與溴化氰活化瓊脂糖凝膠交聯(lián)制備親和層析柱，分離海參腸中乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)，對(duì)其洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示：其適宜平衡體系為含0.3mol/L NaCl的PBS(0.05mol/L，pH7.4)緩沖溶液，適宜洗脫體系為含0.2mol/L四乙基碘化銨的PBS(0.05mol/L，pH7.4)緩沖溶液。此條件下，海參腸AChE可得到較好的吸附和分離，初步純化后的AChE經(jīng)Native-PAGE電泳分離出3條具有酶活性的條帶，說明AChE在海參腸內(nèi)可能以多種形式存在，呈現(xiàn)多態(tài)性。

海參；乙酰膽堿酯酶；親和層析；洗脫條件

海參作為一種重要的海洋棘皮類動(dòng)物，營養(yǎng)價(jià)值及保健功能兼具。但是，海參的自溶現(xiàn)象卻給海參加工、貯藏及運(yùn)輸帶來諸多難題。研究發(fā)現(xiàn)，在海參的自溶過程中，表皮部位細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮、染色質(zhì)聚集化以及邊緣化現(xiàn)象[1]。因此，海參自溶過程可能伴隨有細(xì)胞凋亡、神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)及神經(jīng)損傷等現(xiàn)象。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)作為生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵酶，極有可能參與此過程。對(duì)海參AChE進(jìn)行分離純化，將為進(jìn)一步研究其酶學(xué)特性、豐富海參酶學(xué)理論及闡明海參自溶現(xiàn)象奠定研究基礎(chǔ)。

親和層析是有效的生物活性物質(zhì)分離純化方法之一，在親和層析出現(xiàn)以前，人們一般采用多步的常規(guī)層析方法對(duì)AChE進(jìn)行分離純化，但這種方法操作繁瑣，比較耗時(shí)。Berman等[2]應(yīng)用親和層析技術(shù)對(duì)電鰻和牛紅血球乙酰膽堿酯酶進(jìn)行了分離純化。此后，人們應(yīng)用此技術(shù)相繼從棉蚜蟲[3]、真寬水蚤[4]、果蠅[5]、日本鵪鶉腦[6]、豬腦尾狀核[7]、人腦[8-9]、眼鏡蛇毒[10]、中國丁氏雙鰭電鰩[11]、紫貽貝血淋巴液[12]、鲅魚腦[13]、黃魚腦[14]、黃姑魚[15]和大黃魚肌肉[16]等動(dòng)物組織中分離并提純出AChE。然而，國內(nèi)外尚未見海參AChE分離純化的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參考Massoulie等[17]的方法，以3-羧基苯基-乙基二甲基銨(3-carboxyphenyl ethyldimethyl ammonium，CEA)為配基制備親和柱，對(duì)其分離洗脫AChE條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步純化海參AChE奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮刺參腸，產(chǎn)于秋季(9～11月)，購于大連長興水產(chǎn)市場(chǎng)；DEAE纖維素DE52、溴化氰活化瓊脂糖凝膠4B(CNBr-Sepharose-4B) 瑞典Pharmacia公司；碘化硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine iodide，AcSChI) 美國Fluka公司；1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)earbodiimide metho-p-toluene sulfonata 美國 Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100型分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；Z323K型冷凍離心機(jī) 德國Hermie(哈默)公司；JJ 200Y型精密電子天平 美國雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司；Infinite M 200型酶標(biāo)定量測(cè)定儀 瑞士帝肯(Tecan)集團(tuán)公司；DHL-A電腦恒流泵、DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；垂直板電泳槽、DYY-10C電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 AChE的提取

分別稱取新鮮海參腸適量，與經(jīng)預(yù)冷的含0.1% Triton X-100的PBS緩沖液(0.1mol/L，pH7.4)按1:2(g/mL)低溫勻漿，4℃攪拌提取12h，12000r/min冷凍離心15min，上清液4℃超濾濃縮，分裝，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 AChE活性的測(cè)定

參考Gorun等[18]改進(jìn)的Ellman法，稍作修改測(cè)定酶活，將AcSChI配制成10mmol/L的底物溶液，測(cè)定時(shí)取待測(cè)酶液100μL，加入100μL底物，混勻，30℃孵育15min，加入990μL終止液(含0.125mmol/L DTNB，45%乙醇)終止反應(yīng)并顯色，混勻后取200μL加入96孔板，用酶標(biāo)儀在412nm處測(cè)光密度。酶活力單位(U)定義為每分鐘催化分解底物1nmol為1個(gè)活力單位，按下列公式計(jì)算。

式中：ε為消光系數(shù)取值13.6；L為光程0.5cm；V為反應(yīng)體系的總體積；t為反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3 DEAE-52陰離子交換層析

將海參腸粗酶液2mL上樣于用PBS(0.05mol/L，pH7.4)平衡好的DEAE-52陰離子交換柱(2cm×20cm)，用溶于PBS(0.05mol/L，pH7.4)的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，采用0、0.4、0.75mol/L三個(gè)梯度，每個(gè)梯度洗脫兩個(gè)柱體積，洗脫流速為0.5mL/min。分管收集，每管5mL，整個(gè)分離純化過程均在4℃下進(jìn)行，分別測(cè)定各管洗脫液蛋白質(zhì)含量(以O(shè)D280表示)及乙酰膽堿酯酶活力，繪制酶活力和蛋白質(zhì)含量曲線。合并酶活力較高的洗脫液，超濾濃縮后，用于下一步分離。

1.3.4 親和層析

1.3.4.1 CEA親和柱的制備

以3-羧基苯基-乙基二甲基銨(CEA)為配基，按照Massoulie等[17]的方法制備CEA親和柱。

配基的合成：稱5g 3-二甲基氨基苯甲酸和50mL丙酮于250mL錐形瓶中，加入10mL乙基碘溶解，混合物在60℃條件下攪拌回流24h。白色粉末燒結(jié)瓶過濾，丙酮沖洗晾干，得到5g CEA。

手臂的偶聯(lián)：5g CNBr-Sepharose-4B溶脹于30mL 1mmol/L的HCl溶液中，置于燒結(jié)玻璃瓶內(nèi)，用至少lL相同溶液在水抽吸泵下沖洗。然后，凝膠重新懸浮在30mL偶聯(lián)緩沖液中(10.9g碳酸鈉，碳酸氫鈉8.4g/L，pH10)，加過量已溶1,6-己二胺10mL，用濃鹽酸調(diào)pH10，在室溫?cái)嚢柽^夜(勿用磁力攪拌器)，用乙醇胺5mL(1mol/L，pH8.0)溫育以封閉殘余的活性基團(tuán)，攪勻后在室溫靜置12h，用蒸餾水洗3～5遍。

配基與手臂偶聯(lián)：0.5g CEA溶解于8mol/L NaOH溶液，加到30mL上述處理過的CNBr-Sepharose 4B中，用濃鹽酸調(diào)pH4，然后加入0.25g 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)earbodiimide metho-p-toluenesulfonata。偶聯(lián)反應(yīng)在室溫過夜完成，加1mL乙酸酐進(jìn)行乙酰化，降低自由氨基之間的離子交換作用，用8mol/L NaOH溶液將pH值保持在4～6之間，最后凝膠依次用過量的蒸餾水，lmol/L NaCl溶液和蒸餾水沖洗，即為親和凝膠。

1.3.4.2 海參腸AChE親和層析洗脫條件的優(yōu)化

(1)離子強(qiáng)度對(duì)吸附效果的影響

將制備的親和凝膠裝柱(1.2cm×10cm)，通過改變NaCl濃度改變洗脫液的離子強(qiáng)度，分別以含濃度為0、0.3、0.5mol/L NaCl的 PBS(0.05mol/L，pH7.4)溶液平衡親和柱，取經(jīng)DEAE-52陰離子交換層析收集濃縮后的酶液1mL上樣，并分別用平衡緩沖液洗脫4～6個(gè)柱體積，再用含2mol/L NaCl的PBS緩沖液洗脫，以洗下吸附的AChE和其他蛋白質(zhì)。洗脫速度穩(wěn)定為1mL/3min，分管收集，每管3 mL。

(2)洗脫液的選擇對(duì)分離效果的影響

將制備的親和凝膠裝柱(1.2cm×10cm)，以確定的最佳平衡體系平衡親和柱，取經(jīng)DEAE-52陰離子交換層析收集濃縮后的酶液1mL上樣，用該平衡緩沖液洗脫4～6個(gè)柱體積，以最大程度地吸附AChE并洗去大部分雜蛋白，然后分別選擇含0.0 1 m o l/L四乙基碘化銨(tetraethylammonium iodide，TEA)的PBS(0.05mol/L，pH7.4)、含0.2mol/L TEA的PBS(0.05mol/L，pH7.4)、含0.75mol/L NaCl的PBS(0.05mol/L，pH7.4)緩沖液洗脫2個(gè)柱體積，以洗下絕大部分吸附的AChE，最后用含2mol/L NaCl的PBS緩沖液洗脫，以除去殘留的AChE和其他蛋白質(zhì)。洗脫速度穩(wěn)定為1mL/3min，分管收集，每管3mL。

(3)樣品純度對(duì)分離效果的影響

用(1)確定的最佳平衡緩沖液平衡后的親和凝膠柱(1.2×10cm)，取粗酶液1mL上樣，并用該緩沖液洗脫4～6個(gè)柱體積，再用(2)確定的洗脫緩沖液洗脫2個(gè)柱體積，最后用含2mol/L NaCl的PBS緩沖液沖洗柱子。洗脫速度穩(wěn)定為1mL/3min，分管收集，每管3mL。

1.3.5 電泳分析

參照Laemmli[19]的方法，采用非連續(xù)SDS-PAGE電泳對(duì)DE-2和粗酶經(jīng)親和層析分離后的酶液進(jìn)行純度檢測(cè)，濃縮膠5%、分離膠12%。DE-2經(jīng)親和層析分離后的酶液進(jìn)行Native-PAGE電泳，濃縮膠5%、分離膠8%，然后按照張翰等[20]的方法進(jìn)行活性染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參腸AChE DEAE-52陰離子交換層析

海參腸AChE粗酶樣品按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行DEAE-52陰離子交換層析，結(jié)果如圖1所示。分別采用0、0.4、0.75mol/L三個(gè)濃度梯度的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，分別得到3個(gè)蛋白峰，其中第2個(gè)和第3個(gè)蛋白峰有較高的乙酰膽堿酯酶比活力，分別命名為DE-2和DE-3。其中，DE-2具有較高的酶活力，收集該活性峰，用于下一步的CEA親和柱分離，進(jìn)行洗脫條件的優(yōu)化。

圖1 海參腸AChE的DEAE-52陰離子交換層析Fig.1 Anion exchange chromatography of AChE from the gut of sea cucumber on DEAE-52

2.2 海參腸AChE親和層析洗脫條件的優(yōu)化

2.2.1 離子強(qiáng)度對(duì)吸附效果的影響

圖2 離子強(qiáng)度對(duì)海參腸AChE吸附效果的影響Fig.2 Effect of ionic strength on the adsorption of AChE from the gut of sea cucumber

按照1.3.4.2節(jié)的方法，樣品上柱后，分別以含有0、0.3、0.5mol/L NaCl的PBS(0.05mol/L，pH7.4)緩沖溶液洗脫，然后用含2mol/L NaCl的PBS將結(jié)合到柱上的所有蛋白洗滌下來，對(duì)層析柱進(jìn)行再生，并驗(yàn)證前一階段柱子對(duì)蛋白的吸附情況，結(jié)果見圖2。

結(jié)果顯示，隨著NaCl濃度的增加，配基與酶的結(jié)合力逐漸減弱，對(duì)雜蛋白的洗脫能力也逐漸增強(qiáng)。PBS緩沖液中不含NaCl時(shí)，海參腸AChE幾乎全部吸附到配基上，洗脫液中酶活力僅為0.90U/mL，有少部分雜蛋白被洗脫下來，以含2mol/L NaCl的PBS洗脫時(shí)，AChE隨大部分的雜蛋白一起被洗脫下來(圖2A)。以含有0.3mol/L NaCl的PBS平衡并洗脫時(shí)，少部分AChE未吸附至親和柱上，洗脫液中酶活力達(dá)到1.92U/mL，大部分雜蛋白被洗脫下來，以含有2mol/L NaCl的PBS洗脫時(shí)，AChE隨部分雜蛋白一起被洗脫下來(圖2B)。以含0.5mol/L NaCl的PBS平衡并洗脫時(shí)，只有少部分AChE吸附在配基上，大部分連同雜蛋白被連續(xù)不斷地洗滌下來，在以含2mol/L NaCl的PBS進(jìn)一步洗脫時(shí)，少部分吸附的AChE被洗滌下來(圖2C)。綜合來看，0.3mol/L NaCl既不影響AChE的吸附，又可防止雜蛋白的吸附，有利于提高酶的純度，故選擇含0.3mol/L NaCl的PBS作為平衡緩沖液，并在上樣后洗去未吸附的雜蛋白。

2.2.2 洗脫液的選擇對(duì)分離效果的影響

親和層析的洗脫方法可以分為兩種：特異性洗脫和非特異性洗脫。非特異洗脫是通過改變洗脫液的p H值、離子強(qiáng)度、離子種類或溫度等理化性質(zhì)使固定化配基和生物高分子之間的親和力降低，以至解開生物高分子和親和吸附劑之間的結(jié)合。特異洗脫的方法，利用含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭性結(jié)合，脫附目標(biāo)產(chǎn)物。其優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，可以進(jìn)一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率。本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種洗脫方式進(jìn)行了對(duì)比，其中特異性洗脫中選用乙酰膽堿酯酶的可逆性抑制劑TEA作為競(jìng)爭物對(duì)酶進(jìn)行洗脫，并對(duì)比了兩種不同濃度競(jìng)爭物的洗脫效果。

采用1.3.4.2節(jié)方法，對(duì)吸附在柱上的海參腸AChE進(jìn)行洗脫，結(jié)果如圖3所示。

圖3 洗脫液對(duì)海參腸AChE分離效果的影響Fig.3 Effect of eluent type on the separation of AChE from the gut of sea cucumber

如圖3A所示，以含0.01mol/L TEA的PBS(0.05mol/L，pH7.4)的緩沖液洗脫時(shí)，被洗脫下來的海參腸AChE形成一個(gè)范圍較寬酶活較低的活力峰，繼續(xù)用含2mol/L NaCl的PBS洗脫時(shí)，收集的蛋白峰有較大的酶活力，表明0.01mol/L TEA不能將結(jié)合的全部AChE洗脫下來，需加大洗脫液中競(jìng)爭物的濃度。圖3B、3C顯示，用含2mol/L NaCl的PBS洗脫時(shí)只有雜蛋白峰沒有AChE酶活峰，表明0.2mol/L TEA和0.75mol/L NaCl均可將海參腸AChE全部洗脫下來。相比而言，0.75mol/L NaCl洗脫得到的峰蛋白含量和酶活力均相對(duì)較高，說明隨目的蛋白洗脫出的組分中含有較多的雜蛋白。所以，0.2mol/L TEA進(jìn)行特異性洗脫效果較好，得到的蛋白純度較高，但是在洗脫過程中酶活受到競(jìng)爭物的抑制，可通過透析或超濾等方法去除抑制劑。

2.2.3 樣品純度對(duì)分離效果的影響

親和層析屬吸附層析，樣品純度是影響層析效果的重要因素之一。采用含0.3mol/L NaCl的PBS洗脫，直至OD280＜0.05，然后用含0.2mol/L TEA的PBS(0.05mol/L，pH7.4)洗脫，對(duì)海參腸粗AChE進(jìn)行分離，結(jié)果見圖4。

圖4 海參腸AChE粗酶的親和層析洗脫圖Fig.4 Elution profile of crude AChE from the gut of sea cucumber on affinity chromatography column

海參腸AChE粗酶液上樣后，在目的蛋白結(jié)合階段雜蛋白隨流出液中大部分被去除，在洗脫后期有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，使洗脫體積增大。這可能是因?yàn)锳ChE粗酶液中雜蛋白含量多，通過非特異性吸附結(jié)合于親和柱上。在洗脫時(shí)，這些雜蛋白慢慢地、不斷地解吸下來，造成洗脫體積增大，洗脫時(shí)間時(shí)間延長。

2.3 電泳分析

采用1.3.5節(jié)方法分別對(duì)海參腸AChE粗酶、DE-2以及二者經(jīng)親和層析后得到的組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳純度鑒定，結(jié)果如圖5 A所示。

由圖5A的電泳結(jié)果看出，海參腸AChE粗酶和DE-2經(jīng)電泳分離后顯示若干條帶，經(jīng)親和層析分離后，AChE粗酶分離組分呈現(xiàn)三條蛋白帶，DE-2分離組分呈現(xiàn)兩條蛋白帶。表明親和層析對(duì)AChE粗酶和DE-2有較好的分離效果，但是尚未達(dá)到電泳純，需進(jìn)行進(jìn)一步的純化。

從各種組織和器官中分離純化的AChE具有多種分子型，它們?cè)趤喕M成、分子質(zhì)量、斯托克斯(stokes)半徑、沉降系數(shù)、糖蛋白組成、等電點(diǎn)、水解特性及酶轉(zhuǎn)換數(shù)上有差異的一組酶，稱為AChE的同工酶。DE-2經(jīng)親和層析分離后的組分經(jīng)Native-PAGE電泳分離后進(jìn)行酶活力染色，結(jié)果如圖5B所示。親和層析后的樣品經(jīng)Native-PAGE分離出3條具有酶活性的條帶，說明乙酰膽堿酯酶在海參腸內(nèi)可能以多種形式存在，呈現(xiàn)多態(tài)性，它們可能具有不同的分子量和帶電荷，導(dǎo)致其電泳行為存在差異。不少動(dòng)物組織中都有AChE的同工酶的報(bào)道，在凝膠電泳中，豬腦尾狀核AChE有四條同工酶帶[7]，人腦AChE顯示四條酶活力帶，分別為AChE的二、四、六及八聚體[8]，紫貽貝血淋巴液中AChE的酶活力區(qū)帶數(shù)量則隨季節(jié)變化有明顯差異[12]，至于不同形式的AChE的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系尚待進(jìn)一步的研究。

圖5 海參腸AChE的電泳圖Fig.5 Electropherosis of AChE from the gut of sea cucumber

3 結(jié) 論

采用CEA親和柱對(duì)海參腸AChE進(jìn)行分離過程中，適宜平衡體系為含0.3mol/L NaCl的PBS(0.05mol/L，pH7.4)緩沖溶液，適宜洗脫體系為含0.2mol/L 四乙基碘化銨(TEA)的PBS(0.05mol/L，pH7.4)緩沖溶液。

海參腸AChE經(jīng)Native-PAGE分離出三條具有酶活性的條帶，說明乙酰膽堿酯酶在海參腸內(nèi)可能以多種形式存在，呈現(xiàn)多態(tài)性。

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Optimization of Elution Conditions for Affinity Chromatography of Acetylcholinesterase from the Gut of Sea Cucumber (Stichopus japonicus)

DU Ying，ZHU Bei-wei，WU Hai-tao*
(School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

An affinity chromatography column was prepared by cross-linking of 3-carboxyphenyl ethyldimethyl ammonium(CEA) as a ligand with CNBr-Sepharose-4B and used for an investigation into the optimization of elution conditions for affinity chromatography of acetylcholinesterase (AChE) from the gut of sea cucumber (Stichopus japonica). The appropriate balance system was PBS (0.05 mol/L, pH 7.4) containing 0.3 mol/L NaCl, and the appropriate elution system was PBS (0.05 mol/L, pH 7.4) containing 0.2 mol/L tetraethyl ammonium iodide. Under these conditions, AChE was well adsorbed and separated. Three active bands were separated in the native-PAGE pattern of Preliminarily purified AChE, AChE in the gut of sea cucumber may have different forms and display polymorphism.

sea cucumber；acetylcholinesterase；affinity chromatography；elution conditions

Q556

A

1002-6630(2012)08-0006-05

2011-03-14

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31000754)；遼寧省博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(20101004)

杜英(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工理論與技術(shù)。E-mail：duying1985@126.com

*通信作者：吳海濤(1980—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品深加工。E-mail：wht205@hotmail.com