HPLC-ESI-MS/MS檢測(cè)河豚魚中5種抗生素殘留的方法

田 豐，王 飛，呂 鵬，閆樹(shù)峰，廉 力

(1.黑河出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 黑河 164300；2.秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 秦皇島 066004)

HPLC-ESI-MS/MS檢測(cè)河豚魚中5種抗生素殘留的方法

田 豐1，王 飛2，呂 鵬1，閆樹(shù)峰1，廉 力1

(1.黑河出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 黑河 164300；2.秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 秦皇島 066004)

建立一種同時(shí)測(cè)定河豚魚中林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留的方法。試樣中殘留的抗生素用Tris緩沖溶液提取，經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化后，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀檢測(cè)和確證，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在0.002～0.050μg/mL范圍內(nèi)均呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9977～1.0000；在0.002～0.010mg/kg范圍內(nèi)，樣品平均加標(biāo)回收率在78.9%～109.0%之間，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～5.3%之間，再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.2%～14.5%之間，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素定量限均為2.0μg/kg。

液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜；固相萃取；大環(huán)內(nèi)酯抗生素；河豚魚

河豚魚營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美，被譽(yù)為“魚中之王”。我國(guó)河豚魚產(chǎn)品主要銷往日、韓等國(guó)際市場(chǎng)。我國(guó)的河豚魚以養(yǎng)殖為主，而在養(yǎng)殖過(guò)程中不可避免地使用抗生素類藥物。其中主要為大環(huán)內(nèi)酯類的林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素等。該類抗生素以一個(gè)大環(huán)內(nèi)酯通過(guò)羥基以苷鍵與1～3個(gè)去氧氨基糖或二甲氨基糖縮合成堿性苷，有較強(qiáng)的抗菌活性[1]，曾廣泛地應(yīng)用于食用動(dòng)物作為預(yù)防和治療用藥，通常采用飼料或者注射方式，易在食用肉中殘留，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體。該類藥物對(duì)人體的不良反應(yīng)主要是導(dǎo)致茶堿血濃度升高而致中毒、對(duì)前庭和耳蝸神經(jīng)的損害，嚴(yán)重者造成肝腎損害，甚至死亡。因此，各國(guó)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物殘留均有嚴(yán)格的限量要求，歐盟已禁用，我國(guó)也有相應(yīng)的要求[2-3]。近年來(lái)，日韓等國(guó)針對(duì)該類藥物殘留相繼建立貿(mào)易技術(shù)壁壘，限制和排斥中國(guó)河豚魚出口。因此，建立一種高靈敏度的測(cè)定河豚魚中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測(cè)方法，對(duì)于攻破貿(mào)易技術(shù)壁壘，是十分必要和緊迫的。

測(cè)定大環(huán)內(nèi)酯類抗生素主要分析方法有微生物法[4-5]、熒光光度法[6]、紫外分光光度法[7-8]、薄層色譜法[9-10]、高效液相色譜法[11-12]、毛細(xì)管電泳法[13](capillary electro phoresis，CE)和液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS)聯(lián)用法[14-16]等。在近期的文獻(xiàn)報(bào)道中，測(cè)定大環(huán)內(nèi)酯類殘留，樣品前處理大多采用緩沖溶液提取[17-18]結(jié)合固相萃取技術(shù)分析技術(shù)[19-21]，檢測(cè)主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，該方法靈敏度高、選擇性和特異性好，能夠?qū)Φ蜐舛鹊臉悠愤M(jìn)行很好的定性確認(rèn)。文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定大環(huán)內(nèi)酯類分析方法多應(yīng)用于食品[16-18,22-23]和動(dòng)物產(chǎn)品[24]，未見(jiàn)與河豚魚相關(guān)的檢測(cè)研究。

本方法在參考以上文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，擬建立用Tris緩沖溶液提取殘留物，固相萃取(solid phase extraction，SPE)萃取、凈化，內(nèi)標(biāo)法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(high performance liquid chromatography，HPLC-MS/MS)檢測(cè)河豚魚中5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留的新方法，填補(bǔ)河豚魚進(jìn)出口檢測(cè)要求的空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈均為色譜純；乙酸銨、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、氯化鈣均為分析純；水為GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥95%)：林可霉素(lincomycin，CAS號(hào)：7179-49-9)、竹桃霉素(oleandomycin，CAS號(hào)：7060-74-4)、紅霉素(erythromycin，CAS號(hào)：59319-72-1)、替米考星(tilmicosin，CAS號(hào)：108050-54-0)、泰樂(lè)菌素(tylosin、CAS號(hào)：74610-55-2)、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)羅紅霉素(roxithromycin，CAS號(hào)：80214-83-1)；0.2μm濾膜；Oasis HLB固相萃取柱(500mg，6mL。使用前依次用10mL甲醇和10mL水活化)。

Tris溶液：依次稱取12.0g三羥甲基氨基甲烷和7.35g CaCl2·2H2O溶解于1000mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為9，定容至1000mL。

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確稱取適量大環(huán)內(nèi)酯類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)羅紅霉素，用乙腈溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，得質(zhì)量濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：精確吸取大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1.0mL于10mL容量瓶中，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為10.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要使用前用空白樣品基質(zhì)配成羅紅霉素質(zhì)量濃度200ng/mL，林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素分別為2.0、4.0、10.0、50.0ng/mL的4個(gè)質(zhì)量濃度水平的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 3200 Q TRAP液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀[配有電子電離(electron ionization，EI)源] 美國(guó)Waters公司；旋渦混合器；氮吹儀；高速離心機(jī)(12000r/min)；pH計(jì)；振蕩器。

1.3 分析條件

氣相色譜操作條件：色譜柱：Atlantis C18(150mm× 2.1mm，3μm)。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1% (V/V)甲酸溶液，流動(dòng)相C為甲醇；流速為0.2mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 HPLC分析梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

質(zhì)譜掃描參考條件：離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電噴霧電壓5500V；霧化氣壓力0.24MPa；輔助氣流速0.4L/ min；離子源溫度550℃；碰撞室出口電壓2.0V；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓條件見(jiàn)表2。

表2林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞能量和去簇電壓Table 2 Qualitative ions, quantitative ions, collision energy and cluster voltages for lincomycin, oleandomycin, erythromycin, tilmicosin and tylosin

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

待檢成分提?。悍Q取5g(精確至0.01g)試樣，置于50mL離心管中，加入20.0μL質(zhì)量濃度為10ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液和10.0mL Tris溶液，于振蕩器上劇烈振蕩10min。以12000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液以小于1.0mL/min的流速通過(guò)已活化的Oasis HLB固相萃取柱；再加入10.0mL Tris溶液，于振蕩器上按前述步驟重復(fù)萃取1次，取上清液相同條件過(guò)萃取柱。

待檢成分純化：待樣液全部流出后，先后用10mL水和10mL甲醇溶液(2:3，V/V)洗柱，棄去全部流出液，將固相萃取柱用真空泵抽干。然后用10mL甲醇洗脫于15mL離心管中，用氮?dú)鉂饪s儀于50℃水浴中吹干，準(zhǔn)確加入1.0mL 0.01mol/L乙酸銨溶液-乙腈(17:3，V/V)溶液溶解并定容，于超聲波儀中超聲波助溶約1min。溶液過(guò)0.2μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料，從動(dòng)物組織中提取大環(huán)內(nèi)酯類藥物的主要提取溶液有磷酸鹽緩沖溶液、0.3%偏磷酸-甲醇溶液、乙腈、Tris溶液和乙酸鹽溶液，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同提取溶液的提取效果Table 3 Comparison of the extraction efficiency of five marcolide antibiotics with different extraction solvents

從表3可以看出，當(dāng)用0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液作為提取液時(shí)，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率為0.0%～153.0%；當(dāng)用0.3%偏磷酸-甲醇溶液(7:3，V/V)作為提取液時(shí)，林可霉素的回收率為1.8%，紅霉素的回收率非常不穩(wěn)定(30.0%～106.0%)，其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率回收率為72.0%～106.0%；當(dāng)用乙腈作為提取液時(shí)，除竹桃霉素、泰樂(lè)菌素的回收率大于7 0%外，其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率均小于31.4%；當(dāng)用0.1mol/L乙酸鹽溶液作為提取液時(shí)，替米考星的回收率小于7 0%，其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率均大于70%；當(dāng)用Tris溶液作為提取液時(shí)，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率在78.4%～99.1%范圍。所以本方法采用Tris溶液作為提取液。

2.2 不同固相萃取柱對(duì)回收率的影響

在選定條件下，對(duì)Varian C18、Oasis HLB(500g)、Oasis HLB(200g)、MCX和Bakerbond spe C18五種固相萃取柱的效率進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同固相萃取柱對(duì)回收率的影響Table 4 Effects of different solid phase columns on recovery rate

結(jié)果表明，Oasis HLB(500g)固相萃取柱的效果最理想。因此，本方法選擇Oasis HLB(500g)固相萃取柱為凈化柱。

2.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料記載，大環(huán)內(nèi)酯測(cè)定的內(nèi)標(biāo)物選擇主要有羅紅霉素和林可霉素，對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同內(nèi)標(biāo)物的選擇Table 5 Selection of optimal internal standard

從表5可以看出，當(dāng)用林可霉素為內(nèi)標(biāo)時(shí)，只有替米考星的回收率在94.2%，其余的回收率在94.2%～277.0%之間；當(dāng)用羅紅霉素為內(nèi)標(biāo)時(shí)，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率在76.5%～117.0%范圍。所以本方法采用羅紅霉素作為內(nèi)標(biāo)。

2.4 參考保留時(shí)間

用系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別進(jìn)樣。在儀器最佳工作條件下，以基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量。樣品溶液中，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)。在上述色譜條件和質(zhì)譜條件下，林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素的參考保留時(shí)間分別為6.96、7.36、8.06、8.36、8.48min。

圖1 5種抗生素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)定量限(a)、定量限添加(b)和空白樣品(c)的MRM圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatogram of 5 antibiotics in matrix standard at the level of LOQ(a), spiked samples at the level of LOQ (b) and blank samples (c)

2.5 線性范圍和定量限

配制2.0、4.0、10.0、50.0ng/mL四個(gè)質(zhì)量濃度水平的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，在選定的條件下進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為20μL，用峰高對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中各被測(cè)組分的質(zhì)量濃度做圖。林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素的絕對(duì)量在0.04～1.0ng范圍內(nèi)均呈線性關(guān)系，其線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表6。

表6 5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 6 Linear equations and correlation coefficients of 5 macrolide antibiotics

5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在添加水平2.0～50μg/kg范圍時(shí)，響應(yīng)值在儀器線性范圍之內(nèi)，信噪比RSN大于5。林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)定量限(limit of quantity，LOQ)、定量限添加和空白樣品檢測(cè)的多反應(yīng)檢測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)圖見(jiàn)圖1。

根據(jù)最終樣液所代表的試樣量、定容體積、進(jìn)樣量和進(jìn)行測(cè)定時(shí)所受的干擾情況，確定本方法測(cè)定河豚魚中的林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素的定量限為2.0μg/kg。

2.6 方法的回收率和精密度

用不含該5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的河豚魚樣品進(jìn)行添加回收和精密度實(shí)驗(yàn)，樣品中添加2.0、4.0、8.0、10.0μg/kg四個(gè)不同水平標(biāo)準(zhǔn)后，搖勻，然后按本方法進(jìn)行提取、凈化、測(cè)定。5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率數(shù)據(jù)全部在78.9%～109.0%之間，4個(gè)水平相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于14.17%，說(shuō)明方法的回收率和精密度良好。5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素出峰區(qū)域未見(jiàn)干擾峰，空白樣品實(shí)驗(yàn)也表明，對(duì)于河豚魚樣品，本方法的適用性良好。

2.7 方法的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證

本方法經(jīng)8個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)性和再現(xiàn)性驗(yàn)證。用不含5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的河豚魚樣品分別做2.0、4.0、8.0、20.0μg/kg四個(gè)不同水平的添加回收實(shí)驗(yàn)，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～5.3%之間，再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.2%～14.5%之間，均符合國(guó)際上通用的AOAC標(biāo)準(zhǔn)分析方法對(duì)國(guó)際協(xié)同研究實(shí)驗(yàn)室內(nèi)與實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差之要求。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-ESI-MS/MS同時(shí)測(cè)定河豚魚中林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)方法，方法的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、再現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合國(guó)際上通用的AOAC標(biāo)準(zhǔn)分析方法要求，操作簡(jiǎn)單、回收率穩(wěn)定、靈敏度高、選擇性好、定量同時(shí)可以定性。河豚魚中的5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素定量限達(dá)到2.0ΜG/KG，達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目的，完全滿足世界各國(guó)對(duì)該類藥物殘留限量的檢測(cè)要求，可以應(yīng)用在進(jìn)出口河豚魚檢測(cè)中。

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Determination of 5 Macrolide Antibiotics in Pufferfish Meat by HPLC-ESI-MS/MS

TIAN Feng1，WANG Fei2，LU Peng1，YAN Shu-feng1，LIAN Li1
(1. Heihe Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Heihe 164300, China；2. Qinhuangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qinhuangdao 066004, China)

A method has been developed for the simultaneous determination of five marcolide antibiotic residues including lincomycin, oleandomycin, erythromycin, tilmicosin and tylosin in pufferfish meat. Five antibiotic residues in samples were extracted into Tris buffer. The extract was cleaned up on an Oasis HLB column. The antibiotic residues were determined and confirmed by LC-MS/MS and quantified by an internal standard method. The calibration curves of 5 antibiotics exhibited good linearity in the concentration range of 0.002－0.050μg/mL with a correlation coefficient range of 0.9977－1.0000. The average recovery rates of the marcolide antibiotics from pufferfish samples at spike levels of 0.002－0.010 mg/kg was 78.9%－109.0% with a relative standard deviation of 1.3%－5.3% for repeatability and with a relative standard deviation of 5.2%－14.5% for reproducibility. The detection limit was 2.0μg/kg for these 5 antibiotics.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)；solid phase extraction (SPE)；macrolide antibiotics；pufferfish

TS207.3；O657.63

A

1002-6630(2012)18-0206-05

2011-07-28

田豐(1 97 0—)，女，高級(jí)工程師，學(xué)士，主要從事食品、農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)、獸藥殘留檢測(cè)研究。E-mail：tfhh-8999@163.com