響應(yīng)面分析優(yōu)化菊粉的羧甲基改性工藝

李丹丹，王雪嬌，周 杰，潘 燁，王 爽，高學(xué)佳

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

響應(yīng)面分析優(yōu)化菊粉的羧甲基改性工藝

李丹丹1，王雪嬌1，周 杰2，潘 燁1，王 爽1，高學(xué)佳1

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

研究菊粉的羧甲基改性工藝條件，以堿化時(shí)間、醚化溫度、醚化時(shí)間、堿用量以及氯乙酸用量為影響因素，以羧甲基的取代度為考察指標(biāo)，運(yùn)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出3個(gè)對(duì)菊粉羧甲基取代度影響顯著因素，即堿化時(shí)間、醚化溫度和氯乙酸用量，采用響應(yīng)面分析試驗(yàn)優(yōu)化菊粉的羧甲基改性工藝。菊粉的羧甲基改性最優(yōu)工藝條件為菊粉用量6.8g、堿化時(shí)間30min、醚化溫度81℃、氯乙酸用量2.96g，此時(shí)菊粉的羧甲基取代度為0.66± 0.000167。

菊粉；羧甲基改性；Plackett-Burman試驗(yàn)；響應(yīng)面分析

菊粉又稱為菊糖，在菊科植物如菊芋、大麗菊等的塊莖和菊苣、牛蒡等的根中含量豐富，在植物中代替淀粉成為貯存多糖，是一種功能性的天然寡糖[1-2]。菊粉主要是由β-(2→1)果糖基-果糖為糖苷鍵連接而成的一種果聚糖，其果糖基單位(即聚合度，degree of polymerization，DP)從2個(gè)到60個(gè)不等[3]。菊粉具有降血脂[4]、促進(jìn)金屬離子的吸收[5-6]、增殖雙歧桿菌、調(diào)節(jié)腸道環(huán)境[7-9]等功能。同時(shí)菊粉已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)，并且在日本、歐洲、美國(guó)、臺(tái)灣等地被認(rèn)為是食品和營(yíng)養(yǎng)的增補(bǔ)劑而非食品添加劑，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[10]。幾乎所有的資料都表明，菊粉和低果聚糖不存在安全性方面的擔(dān)憂，研究證明攝人量為40～70g/d時(shí)無(wú)不良的影響[11]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)菊粉的研究還局限在應(yīng)用研究上，對(duì)菊粉的改性研究較少。國(guó)外對(duì)菊粉改性的研究越來(lái)越重視。目前國(guó)外研究較多的改性方式為甲氨?；?、酯化、烷氧基化等。改性菊粉多用于工業(yè)表面活性劑制備，改善水分表面張力或做為食品工業(yè)水處理的阻垢劑等。胡娟等[12]用菊粉與十八烷基異氰酸酯在有機(jī)溶劑中發(fā)生甲氨酰化反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)生成的氨甲基菊粉具有表面活性。羧甲基菊粉由菊粉分子上的伯醇或仲醇基團(tuán)與氯乙酸等含有羧基基團(tuán)(—COOH)的化合物在堿性條件下進(jìn)行取代反應(yīng)而形成。Verraest等[13]對(duì)菊粉的羧甲基改性進(jìn)行了研究，并用液相色譜和核磁共振對(duì)改性的菊粉進(jìn)行了分析。Johannsen[14]對(duì)羧甲基菊粉的毒理學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明具有良好阻垢效果的羧甲基菊粉的安全性和菊粉是一樣的，可以在日常膳食中放心食用。目前世界范圍內(nèi)，國(guó)外科研機(jī)構(gòu)對(duì)菊粉改性的研究相對(duì)成熟，但也只有荷蘭的Sensus和比利時(shí)的Solutia兩家公司在對(duì)菊粉衍生物進(jìn)行聯(lián)合開發(fā)，投入大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)的菊粉衍生物目前僅有羧甲基菊粉，所使用的菊粉是從萵苣的種子中提取的。由于羧甲基菊粉是綠色環(huán)保產(chǎn)品，而且功能獨(dú)特，因而暢銷于歐美市場(chǎng)。

本研究以菊粉為原料制備羧甲基菊粉，其中堿化時(shí)間、醚化溫度、醚化時(shí)間、堿用量以及氯乙酸用量均對(duì)羧甲基的取代度有不同程度的影響，通過Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面分析確定菊粉羧甲基改性的最佳工藝條件，以期為今后菊粉的改性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊粉 荷蘭Sensus公司。

氫氧化鈉、氯乙酸、無(wú)水乙醇(均為AR) 河北省石家莊市金陵科教試驗(yàn)設(shè)備公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL203型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞而電器有限公司；756P型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；電子攪拌器 上海電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菊粉羧甲基改性工藝流程

菊粉在室溫(25℃)溶解度為13.6%，因此取6.8g菊粉溶解于50mL水中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 菊粉羧甲基取代度的測(cè)定[15]

采用光度滴定法對(duì)菊粉的羧甲基化進(jìn)行測(cè)定，因羧甲基菊粉與二價(jià)銅離子的螯合物在241nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)的光吸收。用銅離子濃度為0.8×10-3mol/L的硫酸銅溶液滴定0.5g/L的羧甲基菊粉鈉溶液。令羧甲基菊粉鈉與二價(jià)銅離子生成螯合物，使用紫外-可見分光光度計(jì)在241nm波長(zhǎng)處進(jìn)行滴定。隨滴定進(jìn)行樣品溶液的吸光度不斷增大，滴至螯合完畢，吸光度趨于恒定。此時(shí)通過消耗的硫酸銅溶液的體積可求得羧甲基的含量，進(jìn)而計(jì)算出菊粉羧甲基化的取代度。取代度計(jì)算公式：

式中：W為取代基質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；M為取代基相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)

采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法和Minitab15數(shù)據(jù)處理軟件創(chuàng)建試驗(yàn)次數(shù)N＝12的試驗(yàn)，對(duì)堿化時(shí)間(A)、醚化時(shí)間(B)、醚化溫度(D)、氫氧化鈉用量(E)、氯乙酸用量(G)5個(gè)因素進(jìn)行考察，另設(shè)3個(gè)虛擬列(C、F、H)，以考察試驗(yàn)誤差，以羧甲基取代度為響應(yīng)值考察各因素對(duì)菊粉羧甲基取代度影響的顯著性。

1.3.4 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面分析法(response surface methodology，RSM)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法。本試驗(yàn)利用Design-Expert 6.0.10數(shù)據(jù)處理軟件設(shè)計(jì)一個(gè)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)，得到最佳的菊粉羧甲基改性工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plaekett-Burman試驗(yàn)篩選結(jié)果

選用試驗(yàn)次數(shù)N＝12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)8個(gè)因素(5個(gè)實(shí)際因素、3個(gè)虛擬因素)進(jìn)行考察，分別對(duì)應(yīng)于表1的8列，每個(gè)因素取2個(gè)水平，以羧甲基取代度為響應(yīng)值。選擇置信度較高的因素作為顯著因素進(jìn)一步考察，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示，各因素主效應(yīng)分析結(jié)果如表2所示。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 1 Plackett-Burman design and experimental results

表2 Plaekett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素、水平及顯著性分析Table 2 Factors and levels used in Plackett-Burman design and significance analysis

取代度和羧甲基改性的多糖性能有直接關(guān)系。低取代度產(chǎn)品在某些性能上存在一定的局限性，主要表現(xiàn)在：水溶液抗生物降解性及抗溫性差，在冷水中溶解性較差，抗酸性及抗鈣鎂離子能力低等，這些缺陷會(huì)隨著取代度的增加而減弱。而取代度高的產(chǎn)品具有黏度高且穩(wěn)定，抗酸、抗鹽、耐剪切等性能而更能滿足許多產(chǎn)品性質(zhì)的需求[16-17]。由表1、2可以看出，因素堿化時(shí)間、醚化溫度、氯乙酸用量3個(gè)因素對(duì)羧甲基取代度的影響效果顯著，所以將堿化時(shí)間、醚化溫度和氯乙酸用量這3個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化菊粉羧甲基化改性的條件

2.2.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出得3個(gè)顯著因素，結(jié)合單因素試驗(yàn)，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面因素及水平見表3，響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表4。2.2.2 擬合模型的建立及顯著性分析

表3 菊粉羧甲基化改性響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平Table 3 Factors and levels used in response surface analysis

表4 菊粉羧甲基化改性響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert 6.0.10軟件對(duì)表4中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到菊粉羧甲基取代度對(duì)堿化時(shí)間、醚化溫度和氯乙酸用量的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

取代度＝－0.88130＋0.053563A＋0.011877B＋0.19479C－8.51337×10-4A2－8.50370×10-5B2－0.038148C2＋2.85955×10-6AB－7.02621×10-4AC＋6.41421×10-4BC(2)

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表5可知，回歸模型的的F值為56.03，P＝0.0002＜0.01，表示該模型極顯著。失擬項(xiàng)的F值為2.56，P＝0.1848＞0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著。由表5可知，B、A2、B2、C2項(xiàng)的影響是顯著的，而A、C、AB、BC、AC項(xiàng)對(duì)菊粉羧甲基化取代度的影響是不顯著的。3個(gè)試驗(yàn)條件對(duì)取代度影響的主次順序?yàn)锽＞C＞A。

2.2.3 響應(yīng)曲面交互作用分析及優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)回歸分析結(jié)果做出A、B、C及各因素之間的交互作用對(duì)羧甲基取代度的影響如圖1所示。

圖1 各因素及交互作用對(duì)菊粉羧甲基取代度的影響Fig.1 Response surface of factors and interactions on the degree of substitution of carboxymethyl inulin

從圖1可以看出，每個(gè)因素都有雙向增長(zhǎng)，即因素值增大則響應(yīng)值增大；當(dāng)因素取值增大到一定值時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到極值，之后隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。這是因?yàn)閴A化時(shí)間過短，則構(gòu)建活性中心不完全影響最終試驗(yàn)結(jié)果；堿化時(shí)間過長(zhǎng)，則構(gòu)建的活性中心被破壞，也會(huì)使最終的取代度變小。醚化溫度低時(shí)，分子活性不足影響取代基取代過程；醚化溫度高時(shí)，添加的取代基會(huì)斷裂，分子分解，也會(huì)使最終的取代度變小。氯乙酸用量少時(shí)，取代基添加量少，氯乙酸利用率低；氯乙酸用量過多時(shí)，會(huì)破壞構(gòu)建的活性中心，也會(huì)使最終的取代度變小。

通過對(duì)響應(yīng)曲面的交互作用分析后，發(fā)現(xiàn)各因素之間的交互作用對(duì)取代度有重要的影響。因此需要對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)回歸模型，通過軟件分析得到菊粉羧甲基改性的最優(yōu)工藝條件為堿化時(shí)間30.37min、醚化溫度81.47℃和氯乙酸用量2.96g，在此條件下，菊粉的羧甲基取代度的理論值為0.70，為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，又考慮實(shí)際操作的便利，將最優(yōu)提取工藝條件修正為堿化時(shí)間30min、醚化溫度81℃和氯乙酸用量2.96g，在修正后的優(yōu)化提取工藝條件下，羧甲基菊粉的取代度為0.66±0.000167，因此采用響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，確定菊粉羧甲基改性的最優(yōu)工藝條件為堿化時(shí)間30min、醚化溫度81℃和氯乙酸用量2.96g。在此條件下羧甲基菊粉的取代度為0.66±0.000167。3個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)取代度影響的主次順序?yàn)锽＞C＞A。本研究還有一些需要進(jìn)一步研究解決的問題，如對(duì)羧甲基菊粉的毒理學(xué)研究、羧甲基菊粉做為阻垢劑的應(yīng)用效果等有待于今后進(jìn)一步深入研究。

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Optimization of Inulin Carboxymethylation by Response Surface Analysis

LI Dan dan1，WANG Xue-jiao1，ZHOU Jie2，PAN Ye1，WANG Shuang1，GAO Xue-jia1
(1. College of Biological Science of Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In order to find optimal conditions for the the carboxymethylation of inulin, we investigated the effects of amount of NaOH used for alkalization reaction, alkalization time, amount of chloroacetic acid used for etherification, and etherification temperature and time on substitution degree of carboxymethyl inulin. Using Plackett-Burman design, we identified alkalization time, etherification temperature and chloroacetic acid amount as important conditions that influence substitution degree of carboxymethyl inulin. Response surface methodology was employed to optimize the important conditions. Optimal carboxymethylation of inulin was achieved by alkalization for 30 min and etherification with 2.96 g of chloroacetic acid per 6.8 g of inulin at 81 ℃. The substitution degree of the obtained carboxymethyl inulin was 0.66 ± 0.000167.

inulin；carboxymethylation；Plackett-Burman design；response surface methodology

TS213.2

A

1002-6630(2012)18-0063-04

2011-07-05

李丹丹(1981—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)樘妓衔锱c生物技術(shù)。E-mail：dandan_jiejie@yahoo.com.cn