民族藥金耳環(huán)多糖的提取和含量測定

魏學軍，林先燕，夏亞蘭，劉文蘭，李 江

民族藥金耳環(huán)多糖的提取和含量測定

*魏學軍1，林先燕1，夏亞蘭1，劉文蘭1，李 江2

（1. 黔南民族醫(yī)學高等專科學校，貴州，都勻 558003；2. 貴陽中醫(yī)學院，貴州，貴陽 550001）

探討建立金耳環(huán)多糖的提取和含量測定方法。采用水提醇沉法從金耳環(huán)藥材中提取并分離出粗多糖，經(jīng)除雜、脫蛋白、脫色及脫脂純化后，用分光光度法測定多糖含量。金耳環(huán)精制多糖得率為1.579 0%，多糖質(zhì)量分數(shù)為99.95% ，RSD為0.70%。該方法簡單、快速、靈敏度高、重復性好，可用于金耳環(huán)多糖的含量測定。

金耳環(huán)；多糖；提?。缓繙y定

金耳環(huán)為馬兜鈴科植物金耳環(huán)的干燥全草，主要分布在江西、廣東、廣西等地。金耳環(huán)具有溫經(jīng)散寒，祛痰止咳，散瘀消腫，行氣止痛的功效，其所含成分包括黃酮類、氨基酸、糖類和揮發(fā)油等[1]。由于療效顯著，采集方便，在貴州三都水族集聚地被廣泛的用于風寒感冒、慢性支氣管炎、風寒痹痛、跌打損傷、細菌性痢疾等癥候的治療，水藥記載名為罵廣瓦[2]。其所含多糖類成分是中草藥中重要的活性物質(zhì)，對止咳祛痰、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、降血糖和降血脂等有顯著療效[3-4]，目前有關金耳環(huán)多糖的研究未見文獻報道。課題組同期實驗研究發(fā)現(xiàn)金耳環(huán)具有止咳祛痰[5]、止血的藥理作用，后續(xù)實驗驗證其所含多糖類成分是產(chǎn)生上述作用的重要活性部位（待發(fā)表），故對金耳環(huán)多糖的提取及含量測定進行研究，以期為建立金耳環(huán)的質(zhì)量控制標準和開發(fā)應用提供相關理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

Cary 100型雙光束紫外可見分光光度計（安捷倫科技有限公司）； Mettler AE 240電子天平（瑞士）；DW-60W156超低溫冰箱（青島海爾）；DHG - 9240A真空干燥箱（上海金山）；2.0R大容量低速離心機（德國Heraeus）。葡萄糖標準品（中國食品藥品檢定所，批號：110833–200904），其他試劑均為分析純。金耳環(huán)藥材采于貴州三都水族自治縣境內(nèi)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學院李江教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 金耳環(huán)多糖的提取與精制

取 60 ℃恒溫干燥的金耳環(huán)10 g，充分浸漬，回流提取2次，每次l h。合并濾液并濃縮，加入無水乙醇使含醇量至80%，靜置24 h。傾去上清液，沉淀用去離子水溶解，反復凍融除雜至無沉淀，Sevage 法除蛋白質(zhì)至無游離蛋白(多糖溶液在280 nm處無紫外吸收)，H2O2(15%)脫色。過濾，加入無水乙醇使含醇量至80%，靜置24 h，傾去上清液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚多次洗滌，除去其脂溶性成分。于60 ℃減壓干燥，稱重得精制多糖0.157 9 g，得率為1.579 %[6-7]。

2.2　金耳環(huán)多糖的鑒別

取金耳環(huán)多糖2 mg，用蒸餾水10 mL溶解后精密吸取1 mL至具塞試管中，加入1mL α-萘酚溶液，混勻后沿試管壁加入濃硫酸溶液1 mL，靜置觀察。實驗結(jié)果表明，液面交界處有金耳環(huán)多糖棕紅色環(huán)狀陽性反應。

2.3 金耳環(huán)多糖樣品溶液的制備

精密稱取金耳環(huán)精制多糖20 mg，定容于100 mL量瓶中，再吸取上述溶液1.0 mL定容至10 mL，搖勻得樣品溶液。

2.4 標準曲線的繪制

2.4.1 葡萄糖標準溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品10 mg，置于100 mL量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，配制成100 μg·mL－1的標準葡萄糖溶液備用。

2.4.2 最大吸收波長的確定

精密吸取配制的20 μg·mL－1標準葡萄糖溶液和40 μg·mL－1精制金耳環(huán)多糖溶液各1.0 mL，分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，再迅速沿管壁加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，靜置5 min，置沸水浴中加熱15 min，再置冷水浴中10 min，補充失去的水分至刻度。另以1.0 mL蒸餾水同法操作作為空白對照，在450~530 nm掃描，確定最大吸收波長。實驗結(jié)果表明，葡萄糖和金耳環(huán)多糖均在496 nm處有最大吸收。

2.4.3 標準曲線的繪制

精密吸取“2.4.1”項下標準葡萄糖溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分別加于20 mL的具塞試管中，并分別加蒸餾水補至2.0 mL，配制成5，10，20，30，40，50 μg·mL－1的葡萄糖標準系列溶液，另取2. 0 mL蒸餾水作為空白對照。用“2.4.2”方法顯色后，在最大吸收波長496 nm處測定吸光度，以吸光度()為縱坐標，以葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度(，μg·mL－1) 為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。得標準曲線的回歸方程:= 0.013 6－0.065 9，= 0.999 4。

2.5 換算因子的測定

精密稱取60 ℃干燥恒重的精制多糖20 mg，置于100 mL量瓶中定容。再吸取上述溶液1.0 mL定容至10 mL。吸取2.0 mL上述溶液按“2.4.2”方法顯色后，在496 nm處測定吸光度，按下式計算換算因子：

= W/( C × D )

式中: W 為多糖質(zhì)量( mg ) ，C 為多糖液中葡萄糖的濃度(μg.mL－1) ，D為多糖的稀釋倍數(shù)。測得換算因子= 1.337 3，RSD = 1.32% (= 3)。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取金耳環(huán)多糖樣品溶液1.0 mL，按測定標準曲線的方法，分別在 0.5，1，2，4，8，16，24 h 處測定吸光度，實驗結(jié)果表明，在24 h時吸光度開始下降，說明多糖溶液在16 h以內(nèi)比較穩(wěn)定，RSD為1.87%(前5次)。

2.7 精密度試驗

精密吸取金耳環(huán)多糖樣品溶液1.0 mL，按測定標準曲線的方法，連續(xù)測定6次，其吸光度平均值0.136 1，RSD為1.23%，表明此方法精密度良好。

2.8 重復性試驗

精密吸取金耳環(huán)多糖樣品溶液1.0 mL 6份，按測定標準曲線的方法測定吸光度，RSD為1.64%，重復性良好。

2.9 回收率試驗

精密吸取金耳環(huán)多糖樣品溶液1.0 mL共6份，置于20 mL試管中，分別精密加入10 μg.mL－1葡萄糖標準溶液1.0 mL，按測定標準曲線的方法操作，計算回收率。結(jié)果平均回收率為99.96 %，RSD為0.42%（= 6）。

2.10 樣品中多糖含量的測定

精密吸取金耳環(huán)多糖樣品溶液1.0 mL，按標準曲線制備的方法測其吸光度值，代入回歸方程計算葡萄糖質(zhì)量濃度(μg·mL－1) ，按下式計算多糖質(zhì)量分數(shù):

多糖質(zhì)量分數(shù)% = C × D ×/W × 100%

其中，C 為樣品液的葡萄糖質(zhì)量濃度(μg·mL－1)，D 為樣品的稀釋倍數(shù)，為換算因子，W 為樣品的質(zhì)量(mg)。測定結(jié)果見表1。

表1 多糖質(zhì)量分數(shù)（n = 6）

3 討論

本實驗采用水提醇沉法提取金耳環(huán)粗多糖，經(jīng)分離純化后得精制多糖；然后采用分光光度法在實驗確定的最大吸收波長496 nm處測定多糖含量并計算多糖質(zhì)量分數(shù)。由實驗結(jié)果可知精制多糖得率為1.579 0%，多糖質(zhì)量分數(shù)為99.95%，RSD為0.70%，說明按上述提取方法所得的多糖純度較高。該方法簡便可靠，靈敏度高，穩(wěn)定性和重復性好，可用于金耳環(huán)多糖的提取和含量測定，亦可為金耳環(huán)多糖的其他藥效學研究提供理想的實驗用藥。

課題組在預實驗研究中發(fā)現(xiàn)，純化工藝是影響多糖得率的重要因素之一。凍融除雜和Sevage 法除蛋白質(zhì)次數(shù)超過3次以后，隨著次數(shù)的增加，多糖得率總體呈下降趨勢，多糖質(zhì)量分數(shù)提升不明顯，故本實驗中凍融除雜和Sevage 法除蛋白質(zhì)次數(shù)均固定為3次，這與張曉莉[7]等研究結(jié)果提出的10次以上具有明顯的差異。對其他影響因素，如提取工藝等研究，將繼續(xù)探討。

本實驗是以貴州三都水族自治縣境內(nèi)所采金耳環(huán)為樣本，考慮到不同地區(qū)氣候、海拔、土壤、植被狀況以及采收時間的不同，含量測定結(jié)果是否適用于其他地區(qū)，有待進一步研究。

[1] 中華本草編委會.中華本草(第8卷)[M]. 上海:上?？茖W技術出版社,1999: 504 - 505．

[2] 司有奇,陸龍輝.中國水族醫(yī)藥寶典[M].貴陽：貴州民族出版社，2007:318.

[3] 田庚元,馮宇澄,林潁.植物多糖的研究進展[J].中國中藥雜志,1995,20(7):441.

[4] 申利紅,王建森,李雅,等.植物多糖的研究及應用進展[J].中國農(nóng)學通報，2011，27(2):349 - 352.

[5] 夏亞蘭,魏學軍,林先燕,等.水藥罵廣瓦提取液對小鼠止咳祛痰作用的實驗研究[J].重慶醫(yī)學，2012，41(10)：966 - 967.

[6] 宋晶，吳啟南.芡實多糖的提取及含量測定[J].遼寧中醫(yī),2010,37(7):1331 - 1333.

[7] 張曉莉,李玉婷,王亞賢,等.紅花多糖的提取與含量測定[J].中國實驗方劑學雜志,2010,16(7):19 - 21.

EXTRACTION AND DETERMINATION OF POLYSACCHARIDES FROM ASARUM INSIGNE

*WEI Xue-jun1, LIN Xian-yan1, XIA Ya-lan1, LI Wen-lan1, LI Jiang2

(1. Qiannan Medical College for Nationalities, Duyun, Guizhou 558003, China ;2. Guiyang College of TCM, Guiyang, Guizhou 550001, China)

To establish the method for extraction and determination of polysaccharide form. The crude polysaccharide was obtained by water extraction and alcohol sink method from, after removing impurity, taking off the protein, decoloring and skimmed purification, its content was determined by spectrophotometry. The receiving rate of refined polysaccharide fromis 1. 5790%, its mass fraction is 99. 95% and RSD is 0. 70%.This method is simple, rapid, has high sensitivity and good repeatability. It can be used for content determination of the polysaccharide in.

asarum insigne; polysaccharide; extraction; content determination

R29

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.06.019

1674-8085(2012)06-0086-03

2012-05-12；

2012-08-28

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項資金項目(黔省專合字2010156號)；貴州省黔南州科技局中藥現(xiàn)代化專項資金項目(黔南科合社字201018號)

*魏學軍(1972-），男，四川成都人，副教授，主要從事中藥質(zhì)量控制研究(E-mail：qndywxj@163.com);

林先燕(1972-），女，貴州平塘人，副教授，主要從事天然植物預防保健研究(E-mail：lxyyz2000517@163.com);

夏亞蘭(1980-），女，貴州遵義人，講師，主要從事天然藥物的藥效學研究(E-mail：xiayalan10@163.com);

劉文蘭(1990-），女，湖南邵陽人，碩士生，主要從事中藥質(zhì)量控制研究(E-mail：270066307@qq.com);

李 江(1973-），男，四川江津人，教授，博士，碩士生導師，主要從事天然藥物應用于開發(fā)研究(E-mail：lj2005zy@163.com).