6種中藥提取物消除大腸桿菌耐藥性的研究

張傳津 都業(yè)良 彭媛芳 高迎春（①山東省獸藥質(zhì)量檢驗所 山東 濟南 250022 青島農(nóng)業(yè)大學 山東 青島）

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6種中藥提取物消除大腸桿菌耐藥性的研究

張傳津①都業(yè)良②彭媛芳②高迎春①*（①山東省獸藥質(zhì)量檢驗所 山東 濟南 250022 ②青島農(nóng)業(yè)大學 山東 青島）

通過對15株致病性大腸桿菌耐藥譜的調(diào)查，采用濃度為1000mg/L的地錦草提取物、黃芩苷提取物、蒼術(shù)油、連翹提取物、雪膽提取物和十大功勞提取物對大腸桿菌作用20h，觀察作用前后大腸桿菌對6種抗生素的耐藥率的變化。耐藥譜調(diào)查結(jié)果顯示，10耐及10耐以上的大腸桿菌達80%。經(jīng)不同中藥提取液作用后，地錦草提取液具有比較好的耐藥性恢復作用，十大功勞、黃芩和雪膽提取物的效果次之，而蒼術(shù)油和連翹提取液并無恢復耐藥性的作用。說明部分中藥可恢復耐藥性大腸桿菌對抗生素藥物的耐藥性。

中藥提取物 大腸桿菌 耐藥性 地錦草

由于抗生素的不合理使用，細菌的耐藥現(xiàn)象在全球范圍內(nèi)迅速蔓延，耐藥性的產(chǎn)生使治療細菌感染成為了嚴重困擾動物健康的問題。因此，人們千方百計地從不同途徑尋求克服細菌耐藥性的新方法[1]。20世紀80年代，中草藥和天然植物部分或全部恢復其對抗生素的敏感性成為當今人們關(guān)注的焦點，為解決耐藥性問題提供了一條新途徑[2]。本文對地錦草提取物、黃芩提取物等6種中藥提取物的細菌耐藥性逆轉(zhuǎn)情況進行了探索，為耐藥抑制劑的研發(fā)提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 試驗器械

平皿、酒精燈、錐形瓶、玻璃棒、PH試紙、小試管、高壓鍋、電爐、電子天平、超凈臺、眼科鑷、酒精燈、接種針、培養(yǎng)箱、滅菌棉簽、冰箱、卡尺。

1.2 藥敏紙片

強力霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、氧氟沙星、氨芐青霉素、慶大霉素、新霉素、環(huán)丙沙星、左氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星、氟哌酸。均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 試驗試劑

MH瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 試驗菌株

來自臨床禽源和豬源的15株已經(jīng)過鑒定的大腸桿菌，由山東省動物疫病防控中心提供。

1.5 中藥提取物

采用水提和醇提等方法共得到6種中藥提取物，分別是：地錦草提取物、黃芩苷提取物、蒼術(shù)油、連翹提取物、雪膽提取物和十大功勞提取物，并濃縮至每1ml含生藥1g，流通蒸汽滅菌后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 細菌耐藥譜的調(diào)查

2.1.1 制備接種菌液 選擇瓊脂平板上形態(tài)相似的菌落4~5個，用接種環(huán)挑其頂部，移至4~5ml營養(yǎng)肉湯。35℃培養(yǎng)至菌液濃度為0.5麥氏濃度，約1~2×108cfu/ml。

2.1.2 制備MH瓊脂 瓊脂厚度為4mm，約25~30ml。當日使用或者放于2~8℃冰箱保持，保存時間不得超過7d。其pH為7.2~7.4。

2.1.3 接種平板 校正的菌液在15min內(nèi)使用。用滅菌棉簽蘸取菌液，在試管壁上擠壓除去多余液體，在固體培養(yǎng)基上均勻涂布，蓋好平皿，在室溫中放置5min，待平皿表面稍干后再放含藥紙片。

2.1.4 貼紙片 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼在涂有細菌的培養(yǎng)基表面，均勻地貼在平皿離邊緣15mm處，紙片間的距離應(yīng)超過24mm。貼紙片時可輕壓，以保證與培養(yǎng)基密切接觸，紙片貼上后不可以再移動，因為抗菌素會自動擴散到培養(yǎng)基內(nèi)。

2.1.5 培養(yǎng) 平板35℃倒置培養(yǎng)16~18h。

2.1.6 觀察結(jié)果 觀察含藥紙片周圍有無抑菌環(huán)，并量其直徑(包括紙片直徑)大小，用毫米為單位記錄。

2.1.7 結(jié)果解釋 參考最新2009年1月份的K-B標準與杭州天和微生物試劑有限公司提供的部分標準。

2.2 中藥提取物的耐藥性恢復試驗

2.2.1 中藥最低抑菌濃度測定 將各種中藥稀釋成終濃度為1000mg/ml的藥液。采用試管二倍稀釋法對試驗菌株進行MIC試驗。即取12支無菌試管編號，1~11號無菌試管各加入1×106CFU/ml菌液1ml，取1ml原藥液置于第1號試管中，均勻混合，繼而吸取1ml加入2號試管內(nèi)，依次類推稀釋至10號管，棄去1ml，第11號管作為不加中草藥液的菌液對照管，第12號管只加藥液1ml作為不加菌懸液的中草藥液對照管。搖勻后置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)18h后觀察結(jié)果。

2.2.2 逆轉(zhuǎn)耐藥大腸桿菌的效果測定 用營養(yǎng)肉湯分別將6種中藥提取液稀釋為低于MIC的藥液。分別挑取耐藥性大腸桿菌于各藥液中，分別培養(yǎng)20h后，用無菌棉簽沾取菌懸液涂布于M-H固體平板，根據(jù)抗生素的分類，選擇具有代表性的新霉素、氧氟沙星、頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、阿莫西林和強力霉素6種藥敏紙片做藥敏試驗。同時用無中藥肉湯培養(yǎng)基平行培養(yǎng)相同菌株作為對照。采用改良Kirby-Baller法[2]，按美國國立臨床實驗室標準化委員會2009年版的規(guī)定標準判讀結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 耐藥譜調(diào)查結(jié)果

結(jié)果顯示，15株致病性大腸桿菌對12種常用的抗菌藥物均有不同程度的耐藥。這些菌株中7耐、8耐和9耐各1株。絕大部分菌株都耐10種及10種以上的藥物，共有12株，占所有菌數(shù)的80% ，其中10耐的7株、11耐的1株、12耐的4株。

3.2 耐藥性恢復試驗結(jié)果

3.2.1 最低抑菌濃度測定結(jié)果 通過MIC法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在最高濃度下，6種提取物稀釋液都有細菌增殖，說明5種中藥MIC都大于1000mg/ml。

3.2.2 中藥逆轉(zhuǎn)耐藥菌效果測定 結(jié)果詳見表1。通過試驗發(fā)現(xiàn)，6種中藥提取液對大腸桿菌感觸培養(yǎng)后，耐藥率有不同程度的下降。地錦草提取液相對于其他中藥提取物具有較好的耐藥恢復作用。地錦草作用后，細菌對新霉素、氧氟沙星、頭孢氨芐和強力霉素的耐藥率都下降了6.67%。十大功勞、黃芩苷和雪膽提取物的效果次之。十大功勞作用后，細菌對新霉素和氧氟沙星的耐藥率都下降了6.67%。黃芩苷作用后，細菌對氧氟沙星的耐藥率下降6.67%，雪膽提取物作用后，細菌對強力霉素的耐藥率下降6.67%。而蒼術(shù)油和連翹提取液并無恢復耐藥性的作用。但所有中藥提取液都對環(huán)丙沙星和阿莫西林的耐藥性沒有恢復作用。

表1 六種中藥提取物逆轉(zhuǎn)耐藥性的結(jié)果

4 討論

監(jiān)測細菌的耐藥現(xiàn)狀和變化趨勢，進而研究耐藥性的產(chǎn)生機制并對耐藥性加以控制或消除，對臨床上更合理地用藥控制細菌性感染疾病的流行，生產(chǎn)安全的畜禽產(chǎn)品具有重要的現(xiàn)實和理論意義。本次試驗中的15株菌株中對目前常用的抗菌藥物均全部耐藥，而10耐及10耐以上的“超級菌”達80%。表明本次所用的大腸桿菌對抗菌藥的耐藥已相當嚴重，耐藥率普遍較高，多重耐藥也相當嚴重。細菌耐藥性的形成有多方面的因素，有細菌本身固有的因素，更多的則是細菌在強大的抗生素選擇壓力下，逐步形成了能夠穩(wěn)定遺傳的耐藥特性。一個菌株可以同時具有多種耐藥機制，對一種抗生素的耐藥性也可以由不同的耐藥機制產(chǎn)生。因此，在臨床上應(yīng)該加強細菌耐藥性監(jiān)測，正確使用抗生素，同時加大對耐藥性抑制劑的研究。只有這樣才能有效控制耐藥菌的蔓延，減少耐藥菌帶來的危害，促進畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

降低細菌耐藥性使其部分或全部恢復對抗生素的敏感性，對于臨床治療細菌感染具有重要意義。雖然很多試驗證明蒼術(shù)、金銀花、黃芩、黃連、黃柏、敗醬草、魚腥草、紫草等通過消除R質(zhì)粒的方式來起到恢復耐藥性的作用[3]，但不同研究者對同種藥物和同種細菌的研究結(jié)果也存在較大的差異[4~6]，重復性較差。目前，中藥質(zhì)粒消除作用的具體成分及作用的機制還不清楚。通過本次試驗的中藥逆轉(zhuǎn)耐藥菌效果可知，6種中藥恢復耐藥性的效果以地錦草提取物為最佳，其次是十大功勞、黃芩和雪膽提取物，無效果的是蒼術(shù)油和連翹提取物。

地錦草為一年生草本大戟科植物，全草含黃酮類、沒食子酸、內(nèi)消旋肌醇。中醫(yī)的作用主要是清熱解毒，活血，止血，利濕，通乳。也有治菌痢，腸炎，咳血，吐血，便血，崩漏，外傷出血等功效。由于地錦草的作用最好，建議繼續(xù)針對地錦草進行中藥提取和耐藥性恢復試驗。進一步的改進工藝，對中藥的提取成分進行細化分析，針對性的進行抑制細菌耐藥性的制劑的工藝研究，將有利于生產(chǎn)的提取和研發(fā)。

[1] Emine Kucukates.Antimicrobial resistance among Gram-negative bacteria isolated from intensive care units in a Cardiology Institute in Istanbul, Turkey[J]. Jap J Infect Dis, 2005, 58(4): 228-231.

[2] 劉克, 關(guān)鍵, 李菁華等. 黃芩甙對銅綠假單胞菌R質(zhì)粒的消除作用[J].微生物學雜志, 2003, 23(2): 49-56.

[3] 蔣培余. 中藥抑制劑逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性的研究進展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學報, 2008(10): 53-55.

[4] 于軍, 于紅, 肖洋等. 射干提取液對銅綠假單胞菌PA11株R質(zhì)粒體內(nèi)外消除作用[J]. 吉林大學學報(醫(yī)學版), 2003, 29(2): 170-171.

[5] 苗強, 肖洋, 何中勤. 白頭翁提取液對銅綠假單胞菌R質(zhì)粒的消除作用[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2006, 17(4): 258-259.

[6] 王云, 于軍, 肖洋等. 金銀花水煎劑對綠膿桿菌P29株R質(zhì)粒體內(nèi)體外消除作用的實驗研究[J]. 白求恩醫(yī)科大學學報, 2000, 26(2): 139-140.

（2012–03–31）

國家十一五科技支撐計劃項目:中獸藥現(xiàn)代化技術(shù)研究與開發(fā)，項目編號：2008BADB4B00。

S853.91

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1007-1733(2012)07-0008-03