石榴貯藏期間褐腐病病原菌的分離、鑒定及不同理化因素對(duì)其生長(zhǎng)繁殖的影響

張潤(rùn)光，張有林，趙蕾丹，尹海麗，夏 妮，田玉婷

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

石榴貯藏期間褐腐病病原菌的分離、鑒定及不同理化因素對(duì)其生長(zhǎng)繁殖的影響

張潤(rùn)光，張有林*，趙蕾丹，尹海麗，夏 妮，田玉婷

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

對(duì)引起陜西臨潼和新疆喀什石榴貯藏期間褐腐病的病原菌進(jìn)行了分離與鑒定，研究了溫度、pH、殼聚糖、殺菌劑等理化因素對(duì)石榴病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響。結(jié)果表明，臨潼石榴褐腐病病原菌為黑曲霉（A.niger V.Tiegh.），喀什石榴褐腐病病原菌為紫變青霉（P.purpurogenum Stoll）。0℃的低溫能抑制但不能終止兩種病原菌的生長(zhǎng)；臨潼石榴黑曲霉在pH3～11范圍內(nèi)均有孢子繁殖，pH5時(shí)繁殖最快；喀什石榴紫變青霉在pH7時(shí)孢子繁殖最快，低于或等于3時(shí)停止生長(zhǎng)。多菌靈、銅大師、代森錳鋅對(duì)兩種霉菌生長(zhǎng)的抑制效果不明顯，甲基托布津可完全抑制兩種霉菌的孢子繁殖。殼聚糖安全無毒，對(duì)兩種霉菌均有較好的抑制作用，是一種良好的石榴涂膜保鮮劑。

石榴，褐腐病，病原菌，分離鑒定，理化因素

石榴（Punica granatum L.），屬石榴科石榴屬落葉灌木，在我國(guó)亞熱帶及溫帶地區(qū)的20多個(gè)省市自治區(qū)均有分布。石榴果形奇特，籽粒艷麗，營(yíng)養(yǎng)豐富，味美可口，具有生津化食、祛熱消暑等功效，深受消費(fèi)者喜愛[1]。石榴采后貯藏期間易滋生病菌，導(dǎo)致果實(shí)褐變腐爛[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)引起石榴干腐病的病原菌是石榴鮮殼孢[4]；也有人認(rèn)為石榴發(fā)生軟化腐爛，其病原菌可能為真菌類的曲霉菌[5]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)石榴的研究報(bào)道較多，但主要集中在石榴的營(yíng)養(yǎng)保健功能方面，對(duì)其采后生理病害研究相對(duì)較少[6-8]。本文在對(duì)臨潼石榴和喀什石榴貯藏期間褐腐病病原菌進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，研究了溫度、pH、殼聚糖、殺菌劑等因素對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響，為防治石榴貯期病害、延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴 選用陜西臨潼凈皮甜石榴和新疆喀什甜石榴，采收后在5℃下冷庫(kù)中貯存，待有病菌大量生長(zhǎng)，果實(shí)開始褐變腐爛時(shí)對(duì)病原菌進(jìn)行分離。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)室自制；50%多菌靈超微可濕性粉劑 中國(guó)濰坊華威生化有限公司；銅大師（86.2%氧化亞銅可濕性粉劑） 挪威勞道克斯公司；70%代森錳鋅可濕性粉劑 江蘇福田農(nóng)藥有限公司；70%甲基托布津可濕性粉劑 濱州澳爾農(nóng)化有限公司；殼聚糖 上海源聚生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

MJX-280H型智能霉菌培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；S.SW-CJ-IF型凈化工作臺(tái) 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；GSP-9080MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCD-206T型冰箱

青島海爾股份有限公司；PHS-3C型精密酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石榴褐腐病病原菌的培養(yǎng) 于石榴病斑邊緣（病健交界處）切取3～4mm病斑組織數(shù)塊放入100m L無菌水中，振蕩均勻，分別吸取1m L菌液移至已滅菌的PDA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，無菌刮鏟涂抹均勻，于28℃下培養(yǎng)3d，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 石榴褐腐病病原菌的分離、純化和鑒定 在無菌條件下，用滅菌接種針挑取目標(biāo)菌株于100m L無菌水中制成稀釋菌液，無菌吸管吸取1m L菌液接種于PDA培養(yǎng)基上，無菌刮鏟刮平，置于28℃下培養(yǎng)，如此反復(fù)，直至培養(yǎng)出純化的目標(biāo)菌株。將目標(biāo)菌株在28℃下分別培養(yǎng)5、8、12d，肉眼觀察病原菌在PDA平板上生長(zhǎng)的菌落特征，顯微鏡下觀察病原菌的個(gè)體形態(tài)特征，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其做初步鑒定，然后將菌種樣本送至生物科技公司進(jìn)行測(cè)序（即rDNAITS序列分析），依據(jù)結(jié)果做最終鑒定。

1.2.3 不同理化因素對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。供試菌種經(jīng)5d平板培養(yǎng)，用直徑6mm的打孔器打取菌落邊緣的菌塊，移入供測(cè)定的培養(yǎng)皿內(nèi)，根據(jù)不同要求進(jìn)行處理，每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，處理后5d，用含0.05%吐溫-20的無菌水50m L刮下菌落及孢子，振蕩搖勻，制成均勻的孢子懸浮液。從中取3滴于血球計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下鏡檢，每滴計(jì)5個(gè)視野的孢子數(shù)，求得15個(gè)視野的平均數(shù)，最終統(tǒng)計(jì)出每皿孢子數(shù)量，進(jìn)行方差分析，計(jì)算各處理間孢子數(shù)的差異顯著性[9]。

1.2.3.1 溫度實(shí)驗(yàn) 將移植有菌塊的PDA平板置于28、15、5、0℃環(huán)境下培養(yǎng)5d。

1.2.3.2 pH實(shí)驗(yàn) 用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調(diào)配PDA培養(yǎng)基，使其pH分別為3、5、7、9、11，移入菌塊在28℃下培養(yǎng)5d。

1.2.3.3 殼聚糖實(shí)驗(yàn) 將pH為5.5的殼聚糖溶液經(jīng)滅菌后，加入無菌融化的PDA中，分別獲得殼聚糖濃度為0、0.5、1.0、1.5和2.0mg/m L的PDA培養(yǎng)基，移入菌塊在28℃下培養(yǎng)5d。

1.2.3.4 殺菌劑實(shí)驗(yàn) 將多菌靈、銅大師、代森錳鋅、甲基托布津等高效廣譜殺菌劑分別稀釋600、800、 1000、1200和1500倍，各取1m L稀釋液加入無菌融化的PDA中，凝固后移入菌塊，在28℃下培養(yǎng)5d。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理與分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncans新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)，顯著水平α=0.05[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴褐腐病病原菌的生長(zhǎng)狀況

不同培養(yǎng)基上病原菌的生長(zhǎng)情況不一。一般來說，PDA培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基適合霉菌生長(zhǎng)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基適合細(xì)菌生長(zhǎng)，高氏一號(hào)培養(yǎng)基適合放線菌生長(zhǎng)。由圖1、圖2看出兩種石榴病原菌在PDA培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，而在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)，由此說明石榴貯期褐腐病病原菌為霉菌。

圖1 臨潼石榴褐腐病病原菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況Fig.1 Grownth situation of the pathogen of browning rotten disease from Lingtong pomegranate on differentmedium

圖2 喀什石榴褐腐病病原菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況Fig.2 Grownth situation of the pathogen of browning rotten disease from Kashipomegranate on differentmedium

2.2 石榴褐腐病病原菌的鑒定

通過石榴貯藏期間主要病害癥狀觀察、病原菌個(gè)體形態(tài)觀察（圖3、圖4）和培養(yǎng)菌落形態(tài)觀察（圖1、圖2），經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合分子生物學(xué)測(cè)序，最終鑒定得出臨潼石榴褐腐病病原菌為曲霉屬黑曲霉組的黑曲霉（A.niger V.Tiegh.），喀什石榴褐腐病病原菌為青霉屬紫變青霉組的紫變青霉（P.purpurogenum Stoll）[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑曲霉感染臨潼石榴后，果實(shí)初期呈水漬狀褐班，果面軟化腐爛，后在爛果表面產(chǎn)生大量黑霉點(diǎn)狀物。紫變青霉感染喀什石榴后，受害果實(shí)表面產(chǎn)生青綠色霉層，造成果實(shí)干腐褐變，并發(fā)出特殊香味。

圖3 臨潼石榴褐腐病果實(shí)外觀表現(xiàn)、內(nèi)部性狀及病原菌個(gè)體形態(tài)（×40）Fig.3 Surface symptom,internal character and individual pathogenmorphology of browning rotten disease from Lingtong pomegranate（×40）

圖4 喀什石榴褐腐病果實(shí)外觀表現(xiàn)、內(nèi)部性狀及病原菌個(gè)體形態(tài)（×40）Fig.4 Surface symptom，internal character and individual pathogenmorphology of browning rotten disease from Kashipomegranate（×40）

2.3 不同理化因素對(duì)石榴褐腐病病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響

2.3.1 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響 溫度是影響微生物生長(zhǎng)最重要的因素之一。從表1可以看出，低溫能抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖。培養(yǎng)5d時(shí)經(jīng)測(cè)定，霉菌孢子數(shù)隨溫度的降低而減少，28℃下孢子繁殖最快，0℃下孢子繁殖最慢，各處理間霉菌孢子數(shù)差異顯著。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，兩種病原菌在低溫條件下雖然生長(zhǎng)受到抑制，但仍可緩慢生長(zhǎng)。在0℃下培養(yǎng)90d時(shí)經(jīng)測(cè)定，培養(yǎng)皿中黑曲霉和紫變青霉的孢子數(shù)分別為2.35×108和3.62×108個(gè)，表明低溫對(duì)這兩種病原菌沒有致死作用，因此它們成為低溫貯藏后期引起石榴褐變腐爛的主要病原菌。

表1 不同溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響Table 1 Effectof different temperature on the reproduction of pathogen

2.3.2 pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響 微生物在一定的酸堿環(huán)境下才能正常地生長(zhǎng)繁殖，每種微生物有各自適宜的pH范圍和最適pH。從表2可以看出，臨潼石榴黑曲霉在pH 3～11范圍內(nèi)均有孢子繁殖，且在pH為5時(shí)繁殖速度最快?？κ彩褡献兦嗝闺SpH變化影響較大，pH為7時(shí)孢子繁殖最快，pH低于或等于3時(shí)停止生長(zhǎng)。因此，引起石榴腐爛的黑曲霉、紫變青霉在中性、弱酸、弱堿條件下均能很好地生長(zhǎng)，而強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件則可抑制兩種病原菌的繁殖。

表2 不同pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響Table 2 Effectof different pH on the reproduction of pathogen

2.3.3 殼聚糖對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響 殼聚糖是一種安全無毒的高分子量陽(yáng)離子多糖，能在果蔬表面形成一層半透性薄膜調(diào)節(jié)果蔬采后生理代謝并對(duì)微生物有抑制作用，在果蔬保鮮領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[12]。從表3可以看出，殼聚糖對(duì)臨潼石榴黑曲霉和喀什石榴紫變青霉均有較強(qiáng)的抑制作用。殼聚糖濃度為0.5mg/m L時(shí)，臨潼石榴黑曲霉有孢子繁殖，喀什石榴紫變青霉無孢子繁殖。當(dāng)濃度增大到1.0mg/m L時(shí)，兩種病原菌均停止生長(zhǎng)，因此殼聚糖具有抑制石榴褐腐病病原菌生長(zhǎng)繁殖的作用。

表3 不同濃度殼聚糖對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響Table 3 Effectof different concentration chitosan on the reproduction of pathogen

2.3.4 殺菌劑對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響 多菌靈、銅大師、代森錳鋅和甲基托布津四種殺菌劑均為高效廣譜殺菌劑，分散性和可濕性良好，對(duì)多種病害特別是霉菌有顯著的防治效果。本研究選用上述四種殺菌劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。從表4可以看出，多菌靈對(duì)臨潼石榴黑曲霉的抑制作用較弱，對(duì)喀什石榴紫變青霉的抑制作用相對(duì)較強(qiáng)。銅大師和代森錳鋅對(duì)兩種霉菌的抑制效果不佳。甲基托布津可完全抑制兩種霉菌的孢子繁殖，抑菌效果最好。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)鑒定出石榴貯藏期間褐腐病病原菌主要是霉菌，臨潼石榴病原菌為曲霉屬黑曲霉組的黑曲霉（A.niger V.Tiegh.），喀什石榴病原菌為青霉屬紫變青霉組的紫變青霉（P.purpurogenum Stoll）。

3.2 低溫對(duì)臨潼石榴黑曲霉和喀什石榴紫變青霉有很好的抑制作用，但不能終止其生長(zhǎng)繁殖。

表4 不同殺菌劑對(duì)病原菌生長(zhǎng)繁殖的影響Table 4 Effectof differentgermicide on the reproduction of pathogen

3.3 臨潼石榴黑曲霉在pH3～11范圍內(nèi)均有孢子繁殖，且在pH為5時(shí)繁殖速度最快?？κ彩褡献兦嗝故躳H影響較大，pH為7時(shí)孢子繁殖最快，低于或等于3時(shí)霉菌停止生長(zhǎng)。

3.4 殼聚糖對(duì)臨潼石榴黑曲霉和喀什石榴紫變青霉均有較好的抑制作用，殼聚糖濃度≥1.0mg/m L時(shí)，兩種霉菌停止生長(zhǎng)。多菌靈對(duì)臨潼石榴黑曲霉的抑制作用較弱，對(duì)喀什石榴紫變青霉的抑制作用較強(qiáng)。銅大師和代森錳鋅對(duì)兩種霉菌的抑制效果較差。甲基托布津可抑制兩種霉菌生長(zhǎng)，但具有低毒性。綜合考慮，以殼聚糖涂膜保鮮石榴為好。

[1]高翔.石榴的營(yíng)養(yǎng)保健功能及其食品加工技術(shù)[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2005（7）：40-42.

[2]張潤(rùn)光.我國(guó)石榴貯藏保鮮技術(shù)研究進(jìn)展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（1）：83-85.

[3]張有林，張潤(rùn)光.石榴貯期果皮褐變機(jī)理的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（3）：573-581.

[4]溫鐵漢，劉素玲.石榴干腐病發(fā)生規(guī)律及防治研究[J].中國(guó)果樹，1998（3）：45-48.

[5]付娟妮，劉興華，蔡福帶，等.石榴貯藏期腐爛病害藥劑防治實(shí)驗(yàn)[J].中國(guó)果樹，2005（4）：28-30.

[6]張潤(rùn)光，張有林，邱紹明.石榴復(fù)合貯藏保鮮技術(shù)研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（3）：363-365.

[7]Negi P S，Jayaprakasha G K，Jena B S.Antioxidant and antimutagenic activities of pomegranate peel extracts[J].Food Chemistry，2003，80：393-397.

[8]Shwartz E，Glazer I，Bar-yaakov，I，et al.Changes in chemical constituents during the maturation and ripening of two commercially important pomegranate accessions[J].Food Chemistry，2009，115：965-973.

[9]刁小琴，張有林，關(guān)海寧.冬棗貯期漿胞病病原菌鑒定及病害生理研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29（6）：68-71.

[10]劉魁英，王有年，李永利，等.食品研究與數(shù)據(jù)分析[M].第二版.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005：106-110.

[11]魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：511-512.

[12]張潤(rùn)光，張有林，張志國(guó).三種涂膜保鮮劑對(duì)石榴果實(shí)貯期品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)科技，2008，29（1）：261-264.

Separation and identification the pathogens of browning rotten disease of pomegranate during storage and effect of different physicaland chem ical factors on its reproduction

ZHANG Run-guang，ZHANG You-lin*，ZHAO Lei-dan YIN Hai-li，XIA Ni，TIAN Yu-ting
（College of Food Engineering and Nutritional Science，ShaanxiNormal University，Xi’an 710062，China）

Pathogens causing the browning rotten disease of Shaanxi Lingtong and Xinjiang Kashipomeg ranate fruits during storage were separated and identified.Effect of physical and chemical factors such as temperature，pH，chitosan and germicide on the rep roduction of pomeg ranate pathogen were stud ied in the paper.The result showed that the browning rotten pathogen of Ling tong pomegranate was A.niger V.Tiegh. and the b rowning rotten pathogen of Kashi pomegranate was P.purpurogenum Stoll.These pathogens could be restrained but not be term inated at 0℃.Spores of A.niger V.Tiegh.could b reed between pH3 and pH11，they rep roduced fastest at pH5.Spores of P.purpurogenum Stoll increased fastest at pH7，while they stopped growing at pH≤3.Supp ressive effec t of carbendazim，cup rous oxide and mancozeb on A.niger V.Tiegh.and P.purpurogenum Stoll were not obvious.However，Triophanate-methyl could inhibit the rep roduc tion ofmold spores com p letely.Chitosan was innocuous and had a better inhibitory effect on the mold.It was a good kind of coating antistaling agent for pomeg ranate.

pomeg ranate；b rowning rotten d isease；pathogen；purification and identification；physicaland chem ical factor

TS255.3

B

1002-0306（2012）22-0338-04

2012－08－22 *通訊聯(lián)系人

張潤(rùn)光（1980-），男，博士研究生，研究方向：食品保藏。

陜西省科技廳農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2011NXC01-07）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（GK201004008）；陜西師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（CX12118）；陜西師范大學(xué)“發(fā)展成才計(jì)劃”實(shí)踐創(chuàng)新項(xiàng)目。