孫艷輝,孟金秀,賈小麗,彭曼莉
(滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽滁州 239012)
氨基酸與丙二醛反應(yīng)體系的熒光光譜
孫艷輝,孟金秀,賈小麗,彭曼莉
(滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽滁州 239012)
采用熒光光譜法研究氨基酸與丙二醛的反應(yīng),考察反應(yīng)時(shí)間、pH和濃度對(duì)賴氨酸與丙二醛反應(yīng)體系發(fā)射光譜的影響,并對(duì)不同種類的氨基酸與丙二醛反應(yīng)進(jìn)行比較。結(jié)果表明,氨基酸與丙二醛反應(yīng)生成了400nm激發(fā)、460nm發(fā)射的熒光物質(zhì),該反應(yīng)在中性條件下易于進(jìn)行,并隨時(shí)間延長(zhǎng)產(chǎn)物增多,反應(yīng)體系中,丙二醛濃度高于賴氨酸濃度有利于生成熒光產(chǎn)物。不同氨基酸與丙二醛反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度差異明顯,精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、組氨酸等五種氨基酸易與丙二醛反應(yīng),脯氨酸、羥脯氨酸、色氨酸未能與丙二醛反應(yīng)生成熒光物質(zhì)。
賴氨酸,丙二醛,氨基酸,熒光光譜
食品在加工貯藏過程中易發(fā)生脂肪氧化,造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失和異味產(chǎn)生;同時(shí),脂肪氧化次級(jí)產(chǎn)物攻擊蛋白質(zhì),引起氨基酸側(cè)鏈修飾、蛋白質(zhì)主鏈斷裂和蛋白質(zhì)分子間共價(jià)交聯(lián)[1-2]。其中,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是最重要的脂肪氧化次級(jí)產(chǎn)物,具有很強(qiáng)的生物反應(yīng)活性,幾乎能攻擊所有的生物大分子,導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)的改變和功能的喪失[3-4]。賀洪等[5]采用紫外吸收光譜研究了賴氨酸對(duì)丙二醛的清除作用,發(fā)現(xiàn)在400nm處產(chǎn)生了新的吸收峰。Glomb M A等[6]的研究表明,在室溫和中性pH條件下MDA能與生物分子中的氨基特別是精氨酸,組氨酸,賴氨酸殘基反應(yīng),引起蛋白交聯(lián)。鄧燕等[7]的研究表明MDA與?;撬岱磻?yīng)產(chǎn)生一種類似脂褐素(Ex.392~395nm/Em.456~364nm)的熒光產(chǎn)物1,4-二氫吡啶衍生物。這些研究?jī)H對(duì)部分氨基酸或蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基進(jìn)行研究,而采用熒光分析方法對(duì)全部自由氨基酸與MDA反應(yīng)的研究尚未見報(bào)道。因此,本文采用熒光光譜法對(duì)自由氨基酸與MDA的反應(yīng)進(jìn)行探討,先系統(tǒng)考察pH、時(shí)間、濃度對(duì)賴氨酸與MDA反應(yīng)的產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響,進(jìn)而考察不同種類的氨基酸與MDA反應(yīng)的熒光產(chǎn)物情況。
1.1 材料與儀器
十九種氨基酸 北京科康生物科技有限公司;1,1,3,3-四乙氧基丙烷 阿拉丁試劑有限公司;鹽酸等 均為分析純。
Cary eclipse型分子熒光分光光度計(jì) Varian,美國(guó)瓦里安公司;精密天平,恒溫水浴鍋。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 MDA的配制 按照王愛國(guó)[8]的方法,先配制1.5×10-4mol的1,1,3,3-四乙氧基丙烷水溶液,加入1mol/L鹽酸1m L和超純水50m L,將溶液在50℃的水浴中放置1h,即成MDA溶液。1mol的1,1,3,3-四乙氧基丙烷完全水解后可得1mol的MDA。冷卻后定容至100m L,4℃冷藏保存。
1.2.2 反應(yīng)體系的配制 將MDA和氨基酸按1∶1摩爾比配制,去離子水分別定容至刻度,搖勻,置于37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1h,水浴冷卻至25℃后測(cè)定熒光光譜。
1.2.3 熒光光譜的繪制 以400nm為激發(fā)波長(zhǎng),420~600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描得到熒光發(fā)射光譜;以460nm為發(fā)射波長(zhǎng),350~450nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描得到熒光發(fā)射光譜;固定Δλ=60nm,在240~700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描得到同步熒光光譜;掃描時(shí)激發(fā)狹縫5nm,發(fā)射狹縫10nm。波長(zhǎng)掃描速度為600nm/min。
1.2.4 pH對(duì)賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜的影響 采用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)賴氨酸MDA反應(yīng)體系的pH為1.8、2.2、2.6、3.0、3.7、6.0、6.6、6.9、7.2、9.4、10.5、12后,按1.2.2方法反應(yīng)后測(cè)定熒光發(fā)射光譜。
1.2.5 時(shí)間對(duì)賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜的影響 pH為6.0的賴氨酸MDA反應(yīng)體系分別按按1.2.2方法反應(yīng)0.5、1、1.5、2、3h后測(cè)定熒光發(fā)射光譜。1.2.6 濃度對(duì)賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜的影響 pH為6.0的賴氨酸MDA反應(yīng)體系,賴氨酸濃度為0.01mmol/L時(shí),MDA濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mmol/L;賴氨酸濃度為0.01mmol/L時(shí),MDA濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mmol/L;按1.2.2方法反應(yīng)2h后,測(cè)定熒光發(fā)射光譜。
1.2.7 不同種類氨基酸與MDA反應(yīng)的體系熒光發(fā)射光譜 二十種氨基酸,按氨基酸濃度為0.05mmol/L、MDA濃度為0.05mmol/L配制反應(yīng)液;采用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH為6,按1.2.2方法反應(yīng)2h后測(cè)定熒光發(fā)射光譜。
1.2.8 色氨酸MDA反應(yīng)體系的熒光發(fā)射光譜 按色氨酸濃度為0.05mmol/L、MDA濃度為0.05mmol/L配制反應(yīng)液;采用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH為6,按1.2.2方法反應(yīng)5、7、15、24、48h后測(cè)定同步熒光光譜。
1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法
采用Matlab 9.0軟件作圖。
2.1 賴氨酸MDA反應(yīng)體系的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜
對(duì)賴氨酸MDA體系反應(yīng)1h后按1.2.2方法掃描激發(fā)光譜與發(fā)射光譜,結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),賴氨酸MDA體系在400nm波長(zhǎng)處有最大吸收,在461nm波長(zhǎng)處有最大發(fā)射,而賴氨酸、丙二醛在該處均不出峰,說明賴氨酸MDA體系反應(yīng)產(chǎn)生了新物質(zhì)。該物質(zhì)的熒光特征和鄧燕等人的研究結(jié)果一致[7],說明該物質(zhì)可能是類脂褐質(zhì)。為研究方便,后續(xù)研究均是對(duì)反應(yīng)體系的發(fā)射光譜開展(Ex.400nm)探討。
圖1 賴氨酸MDA反應(yīng)體系的激發(fā)光譜和與發(fā)射光譜Fig.1 The excited and emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system
2.2 pH對(duì)賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜的影響
pH對(duì)賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜的影響如圖2所示。由圖2可以看出,pH為1.8時(shí),賴氨酸MDA反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度最低,隨著pH由低到高,賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度先升高,在pH為6.0時(shí)為最大,然后降低。這說明,偏中性的反應(yīng)體系有利于賴氨酸與MDA反應(yīng),這與賀洪的研究結(jié)果一致[5]。后續(xù)研究過程中反應(yīng)體系pH選為6.0。
圖2 pH對(duì)賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜的影響Fig.2 Effectof pH on the emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system
2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜的影響
賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜隨時(shí)間變化的結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),賴氨酸MDA反應(yīng)體系的在461nm處的熒光強(qiáng)度越來越大。這說明產(chǎn)生的熒光物質(zhì)越來越多。后續(xù)研究的反應(yīng)時(shí)間定為2h。
圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜的影響Fig.3 Effectof reaction time on the emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system
2.4 濃度對(duì)賴氨酸MDA反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜的影響
賴氨酸與MDA濃度比例發(fā)生變化時(shí),其熒光產(chǎn)物的量也發(fā)生變化,結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出,當(dāng)賴氨酸濃度固定為0.01mmol/L時(shí),隨著丙二醛濃度從0.01mmol/L升高到0.05mmol/L時(shí),反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度升高;而當(dāng)賴氨酸濃度固定為0.05mmol/L時(shí),隨著丙二醛濃度從0.01mmol/L升高到0.05mmol/L時(shí),反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度升高,但最終的熒光強(qiáng)度比較小;這說明,反應(yīng)體系中,丙二醛濃度越高于賴氨酸濃度時(shí),熒光強(qiáng)度越高。已有文獻(xiàn)表明:一定條件下高濃度的MDA能夠形成乙醛,兩分子MDA和一分子乙醛能與帶初級(jí)氨的化合物反應(yīng)生成二羥吡啶加成物[9-10],這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
圖4 賴氨酸與MDA濃度比對(duì)反應(yīng)體系熒光發(fā)射光譜的影響Fig.4 Effectof concentration on the emission fluorescence spectroscopy of lysine-MDA system
2.5 酸性側(cè)鏈和堿性側(cè)鏈與MDA反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜
為研究氨基酸種類與丙二醛反應(yīng)的熒光特征,首先分別對(duì)酸性側(cè)鏈氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺),堿性側(cè)鏈氨基酸(組氨酸、賴氨酸、精氨酸)與MDA體系的熒光發(fā)射光譜進(jìn)行掃描,結(jié)果如圖5所示。
圖5 酸性側(cè)鏈和堿性側(cè)鏈氨基酸與MDA反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜Fig.5 The emission fluorescence spectroscopy of lacid or basic chain AA-MDA system
由圖5可以看出,精氨酸與MDA反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度最高,賴氨酸次之、組氨酸第三、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺相差不大。對(duì)于酸性和堿性側(cè)鏈來說,氨基酸易于電離,易于發(fā)生反應(yīng)。其中,精氨酸的氨基、亞氨基最有利于反應(yīng),熒光強(qiáng)度最高。賴氨酸、組氨酸也是同樣道理[11]。
2.6 短小側(cè)鏈氨基酸與MDA反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜
對(duì)蘇氨酸、絲氨酸、亮氨酸、甘氨酸與MDA反應(yīng)體系的熒光發(fā)射光譜進(jìn)行掃描,結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出,甘氨酸與MDA反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度最高,絲氨酸的次之、蘇氨酸的第三、丙氨酸的最小。這與甘氨酸的結(jié)構(gòu)有關(guān),在甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸四種氨基酸中,甘氨酸其空間位阻最小,反應(yīng)最易進(jìn)行,反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度最大[11]。
圖6 短小側(cè)鏈氨基酸與MDA反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜Fig.6 The emission fluorescence spectroscopy of little side chain AA-MDA system
2.7 長(zhǎng)大側(cè)鏈氨基酸與MDA反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜
對(duì)色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸與MDA反應(yīng)體系的熒光發(fā)射光譜進(jìn)行掃描,結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出,苯丙氨酸與MDA反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度最高,甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸相差較小、酪氨酸的反應(yīng)峰微小,色氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸不能與MDA反應(yīng)產(chǎn)生。這與長(zhǎng)大側(cè)鏈氨基酸的結(jié)構(gòu)有關(guān),側(cè)鏈長(zhǎng)大導(dǎo)致空間位阻大,反應(yīng)難于進(jìn)行,反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度就越小。另外,脯氨酸和羥脯氨酸沒有單獨(dú)的氨基,故反應(yīng)難于進(jìn)行[11]。
圖7 長(zhǎng)大側(cè)鏈氨基酸與MDA反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜Fig.7 The emission fluorescence spectroscopy of long side chain AA-MDA system
對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間的色氨酸MDA體系的同步熒光光譜進(jìn)行掃描,結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出,隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),色氨酸熒光強(qiáng)度逐漸降低,未發(fā)現(xiàn)新的熒光峰出現(xiàn)。說明MDA對(duì)色氨酸具有熒光猝滅作用,二者未產(chǎn)生新的熒光物質(zhì)。這可能是色氨酸的吲哚環(huán)結(jié)構(gòu)抑制了其與MDA的反應(yīng)。
圖8 色氨酸與MDA反應(yīng)體系的同步熒光光譜Fig.8 The synchronouns fluorescence spectroscopy of tryptophan-MDA system
賴氨酸與丙二醛反應(yīng)生成400nm激發(fā)、460nm發(fā)射的熒光物質(zhì),該反應(yīng)在中性條件下易于進(jìn)行,并且隨時(shí)間延長(zhǎng)熒光產(chǎn)物增多;反應(yīng)體系中,丙二醛濃度高于賴氨酸濃度有利于生成熒光產(chǎn)物。不同氨基酸與丙二醛反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度差異明顯,精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、組氨酸等五種氨基酸易與丙二醛反應(yīng),而脯氨酸、羥脯氨酸、色氨酸未能與丙二醛反應(yīng)生成熒光物質(zhì)。
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Fluorescence spectroscopy of the reaction system between am ino acid and malondialdehyde
SUN Yan-hui,MENG Jin-xiu,JIA Xiao-li,PENG M an-li
(School of Bio&Food Engineering,Chuzhou University,Chuzhou 239012,China)
The reac tion between am ino acid and malondialdehyde(MDA)was stud ied by fluorescence spectroscopy.The effec t of time,pH and concentration on the em ission spectroscopy of lysine-MDA system was researched,and the reaction charactertic of 19 kinds of am ino acid w ith MDA was compared.The result showed the p roduct of AA-MDA system had Ex.400nm and Em.460nm,easier to happen under the neutral cond ition,w ith the reaction time p rolonged,the fluorescence p roduct inc reased.The concentration of MDA was much more than that of lysine,more fluorescence p roduct increasing.The fluorescence intensity had significant d ifference among kinds of AA-MDA.Arginine,lysine,histidine and g lycine could easier react w ith MDA to p roduce fluorescence p roduct,while p roline,hyd roxyp roline and tryp tophan could not.
lysine;malond ialdehyde;am ino acid;fluorescence spectroscopy
TS201.2
A
1002-0306(2012)22-0042-04
2012-08-28
孫艷輝(1978-),男,博士,副教授,研究方向:食品質(zhì)量安全。
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30901129);安徽省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全特色專業(yè)基金項(xiàng)目(20101032)。