HPLC法同時測定不同品種溪黃草中3種三萜類成分的含量

吳澤青，帥 歐，林 勵，*，邱戊盛，歐先濤，吳攀創(chuàng)

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006;

2.廣東萬年青制藥有限公司，廣東汕頭 515064)

HPLC法同時測定不同品種溪黃草中3種三萜類成分的含量

吳澤青1，帥 歐1，林 勵1，*，邱戊盛2，歐先濤2，吳攀創(chuàng)2

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006;

2.廣東萬年青制藥有限公司，廣東汕頭 515064)

目的:建立同時測定溪黃草中科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸含量的高效液相色譜法。方法:采用Synergi 4u Fusion RP 80A C18(250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex company)色譜柱;流動相:甲醇(A)－0.2%磷酸水(B)(V∶V= 9∶1);等度洗脫;流速:0.6mL·min－1;檢測波長:210nm;柱溫30℃。結(jié)果:科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸分別在0.111～1.111mg/mL(r=0.9999)、0.026～0.256mg/mL(r=0.9999)、0.307～3.067mg/mL(r=0.9999)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為97.72%、97.08%和97.46%(n=6)，RSD分別為1.24%、1.62%和1.25%。結(jié)論:本法快速、簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于溪黃草3種主要成分定量分析和質(zhì)量控制。

溪黃草，三萜，高效液相色譜法，測定

中藥溪黃草為民間習(xí)用草藥，用于治療濕熱瀉痢，跌打瘀腫，急性黃疸型肝炎，急性膽囊炎等疾?。?］，臨床使用廣泛。溪黃草具有保肝抗癌等作用，溪黃草中的科羅索酸和2α，19－二羥基熊果酸具有體外抗乙肝病毒的作用，熊果酸類成分具有顯著的抑制乙肝病毒作用［2－4］。溪黃草為嶺南特色藥材，在廣東各地臨床應(yīng)用普遍，并出現(xiàn)以之為主要原料的保健產(chǎn)品，如溪黃草茶、溪黃草顆粒等，溪黃草在保健品開發(fā)方面具有較大潛力，但尚無較全面的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對其藥材及產(chǎn)品進(jìn)行規(guī)范。目前市場上作

“溪黃草”入藥的原植物有線紋香茶菜Rabdosia Iophan－thoides(Buch.－Ham ex D.Don)Hara.及同屬植物狹基線紋香茶菜R.lophanthoides var.gerardiana(Benth.)Hara.、纖花香茶菜R.lophanthoides var.graciliflora(Benth.)Hara.和溪黃草R.serra(Maxim.) Hara.或R.lasiocarpa(Hayata)Hara.［5－6］。溪黃草含萜類、黃酮類、酚類、氨基酸等多種化學(xué)成分。目前對于溪黃草中三萜類成分含量測定的文獻(xiàn)多集中在齊墩果酸［7］、熊果酸［8］、科羅索酸［9－10］等成分。尚未見同時測定四種不同基源的溪黃草多種三萜類成分含量的文獻(xiàn)報道，本工作采用高效液相色譜法(HPLC)對四種不同基源溪黃草三萜類成分含量進(jìn)行研究，為進(jìn)一步提高溪黃草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究水平提供科學(xué)依據(jù)。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Results of linear relationship

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溪黃草藥材 由廣東萬年青制藥有限公司提供，并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林勵研究員鑒定為線紋香茶菜Rabdosia Iophanthoides(Buch.－Ham ex D.Don)Hara.、狹基線紋香茶菜Rabdosia lophanthoides var.gerardiana(Benth.)Hara.、纖花香茶菜Rabdosia lophanthoides var.graciliflora(Benth.)Hara.和溪黃草Rabdosia serra(Maxim.)Hara.;齊墩果酸、科羅索酸、熊果酸對照品 購自曼思特生物科技有限公司，批號分別為:MUST－09071701、MUST－10021301、MUST－10111201，純度≥98%;乙腈 色譜純，默克公司;磷酸 天津科密歐化學(xué)試劑廠，優(yōu)級純;甲醇、氯仿、鹽酸 廣州化學(xué)試劑廠，分析純;水為超純水;微孔濾膜 天津津騰公司。

Waters e2695一體機(jī)、Waters 2998 PDA檢測器

Waters公司;8002型電熱恒溫水浴鍋 上海市精慧儀器公司;XS 225A型分析天平 Sartorius公司; DFT－200型手提式高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為 Synergi 4u Fusion RP 80A C18(250mm × 4.6mm，5μm，Phenomenex company);流動相:甲醇(A)－0.2%磷酸水(B)(V∶V =9∶1);流速0.6mL·min－1;檢測波長:210nm;柱溫: 30℃;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取五氧化二磷干燥24h以上的科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸對照品適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL分別含科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸111.11、25.56、306.67μg的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取溪黃草藥材適量，粉碎，過二號篩，精密稱取4.0g，置150mL圓底燒瓶中，精密加入氯仿100mL，稱定重量，回流提取1h，過濾，取濾液真空濃縮，殘渣用甲醇分次溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 系統(tǒng)適用性實驗 分別吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入色譜儀，按上述色譜條件測定。在此條件下科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸峰與樣品中其它成分峰均能達(dá)到基線分離。三成分與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于3000。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC色譜圖

四種溪黃草HPLC色譜圖如圖1所示。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

圖1 四種溪黃草HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of four kinds of Linearstripe Rabdosia Herb

精密吸取混合對照品溶液2、6、10、12、16、20mL，分別置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密吸取10μL，按1.2.1的色譜條件進(jìn)樣分析，以各自的峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，濃度X(mg·mL－1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程及線性范圍見表1。

2.3 精密度實驗

在上述色譜條件下，精密吸取混合對照品溶液連續(xù)測定6次，進(jìn)樣量為10μL，測定峰面積，結(jié)果見表2，科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸峰面積RSD分別為1.52%、1.17%、0.75%，表明精密度良好。

2.4 重復(fù)性實驗

精密稱取同一樣品(狹基線紋香茶菜1批)6份，按1.2.3的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，測得溪黃草樣品中科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸峰面積RSD分別為0.75%、1.22%、0.90%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好，見表3。

2.5 穩(wěn)定性實驗

在上述色譜條件下，取同一樣品(狹基線紋香茶菜1批)，分別于0、2、4、6、12、24h測定，測得溪黃草藥材樣品中科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸峰面積RSD分為1.27%、1.54%、1.36%。結(jié)果表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定，見表4。

2.6 加樣回收率實驗

取同一批已知科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸含量的供試品(科羅索酸含量0.3820mg/g，齊墩果酸含量0.0993mg/g，熊果酸含量1.1582mg/g)，平行6份，每份取樣量約2g，精密稱定。按當(dāng)前取樣含量約1∶1精密加入科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸對照品，照1.2.3的方法制備供試品溶液。進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果見表5～表7，科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸平均回收率分別為97.72%、97.08%、97.46%，RSD分別為

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2 Results of precision test

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 3 Results of repeated test

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 4 Results of stability test

表5 科羅索酸加樣回收實驗結(jié)果Table 5 Results of the recovery test of Corosolic acid

表6 齊墩果酸加樣回收實驗結(jié)果Table 6 Results of the recovery test of Oleanolic acid

表7 熊果酸加樣回收實驗結(jié)果Table 7 Results of the recovery test of Ursolic acid

1.24%、1.62%、1.25%。表明方法的準(zhǔn)確度較好。

2.7 樣品含量測定

分別取待測樣品，按1.2.3的方法制備供試品溶液，在1.2.1色譜條件下，進(jìn)行樣品含量測定，結(jié)果見表8。

3 結(jié)論

本法快速、簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于溪黃草藥材3種主要成分定量分析和質(zhì)量控制。不同基源的溪黃草藥材科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸含量有所不同。四種藥材中科羅索酸含量由高到低順序排列分別為溪黃草、線紋香茶菜、狹基線紋香茶菜及纖花香茶菜;齊墩果酸含量由高到低順序排列分別為溪黃草、線紋香茶菜、狹基線紋香茶菜及纖花香茶菜;熊果酸含量由高到低順序排列分別為狹基線紋香茶菜、纖花香茶菜、線紋香茶菜及溪黃草。

表8 四種溪黃草含量測定結(jié)果Table 8 Results of contents of Linearstripe Rabdosia Herb

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(下冊)［M］.上海:上海人民出版社，1977:2511.

［2］胡英杰，賴小平，劉中秋，等.狹基線紋香茶菜(溪黃草)的化學(xué)成分與抗乙肝病毒作用研究［J］.中草藥，2005，36(11): 1612－1615.

［3］謝春英.溪黃草提取物預(yù)防大鼠急性肝損傷的實驗研究［J］.中藥材，2007，30(12):1582－1583

［4］劉銀花，陳秀琴，沈婕，等.溪黃草配伍虎杖煎劑對大鼠實驗性肝損傷的保護(hù)作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(2): 334－335.

［5］陳建南，賴小平，劉念.廣東溪黃草藥材的原植物調(diào)查及商品鑒定［J］.中藥材，1996，19(2):73－74.

［6］賴小平，陳建南，陳林奴，等.中藥溪黃草的研究進(jìn)展［J］.廣州中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1995，12(4):56－58.

［7］劉凡.溪黃草的生藥學(xué)研究［D］.廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2010:47－53.

［8］李楚源，鄧喬華，黃琳，等.溪黃草中熊果酸含量測定方法學(xué)研究［J］.中外醫(yī)療，2009(28):155－156.

［9］吳劍鋒，劉斌，祝晨蔯，等.不同采收期溪黃草中2α－羥基熊果酸含量的動態(tài)研究［J］.中草藥，2004，31(1):81－83.

［10］吳劍鋒，劉斌，祝晨蔯，等.不同施肥區(qū)域溪黃草中2α－羥基熊果酸含量的比較［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2004，28(7):318－321.

HPLC simultaneous determination of three triperpenoids components in Linearstripe Rabdosia Herb from different species

WU Ze－qing1，SHUAI Ou1，LIN Li1，*，QIU Wu－sheng2，OU Xian－tao2，WU Pan－chuang2
(1.School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medcine，Guangzhou 510006，China;
2.Guangdong Enterlife Pharmacy Company Limited，Shantou 515064，China)

Objective:To establish an HPLC method for simultaneous determination of 2α－h(huán)ydroxy－ursolic acid，oleanolic acid and ursolic acid in Linearstripe Rabdosia Herb from different species.Methods:The HPLC system consisting of Synergi 4u Fusion RP 80A C18column(250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex company)and a solution system of methanol－phosphoric acid(V∶V=9∶1)as the mobile phase with isocratic elution was adopted.The flow rate was set at 0.6mL·min－1，the detection wavelength was 210nm and the column temperature was 30℃.Results: The linear ranges of 2α－h(huán)ydroxy－ursolic acid，oleanolic acid and ursolic acid were 0.111～1.111mg/mL(r=0.9999)，0.026～0.256mg/mL(r=0.9999)，0.307～3.067mg/mL(r=0.9999)respectively.Conclusion:The average recoveries(n =6)were 97.72%(RSD=1.24%)，97.08%(RSD=1.62%)，97.46%(RSD=1.25%)respectively.The method was quick，simple and accurate with good reproducibility and could be used for determination and quality control of the three main components in Linearstripe Rabdosia Herb.

Linearstripe Rabdosia Herb;triperpenoids;HPLC;determination

TS218

A

1002－0306(2012)21－0296－04

2012－04－23 *通訊聯(lián)系人

吳澤青(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:中藥資源開發(fā)與新藥研究。