響應面法優(yōu)化研磨珠輔助超聲波萃取蘋果多酚的工藝研究

周麗萍，楊瑞華，張 悅，*

(1.黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱150040; 2.黑龍江省農業(yè)科院園藝分院，黑龍江哈爾濱 150040)

響應面法優(yōu)化研磨珠輔助超聲波萃取蘋果多酚的工藝研究

周麗萍1，楊瑞華2，張 悅1，*

(1.黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱150040; 2.黑龍江省農業(yè)科院園藝分院，黑龍江哈爾濱 150040)

采用研磨珠輔助法萃取蘋果多酚，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化萃取工藝。結果表明，研磨珠輔助萃取蘋果多酚的最佳工藝條件為:超聲時間23min，超聲溫度50℃，超聲功率244W，珠加載量(珠∶料，g/g)1.25∶1，在此條件下蘋果多酚得率為1.031mg/g。研磨珠輔助萃取與傳統(tǒng)的超聲波萃取法比較，蘋果多酚得率提高了33.68%。

響應面，蘋果多酚，萃取，研磨珠

蘋果多酚(Apple polyphenol)是蘋果中所含多元酚類物質的統(tǒng)稱，是具有苯環(huán)并結合多個羥基化學結構的總稱，是一類成份復雜的混合物。近年來大量研究顯示，蘋果多酚具有抗癌、抗氧化、抗動脈硬化、保護軟骨與增強骨質、生發(fā)烏發(fā)、保護視網膜、抑菌、抗視力退化、抗過敏、防齲齒、防輻射、防治冠心病與中風等多種藥理功能，其中抗氧化能力是VE的5倍、VC的20倍［1－3］，且在一定劑量范圍內是安全、無毒的［4］，所以蘋果多酚將成為未來最具潛力的保健品。提取是有效成分分析和研究的基礎，所以選擇適當的提取方法，不但可以提高目標產物的得率，而且可以節(jié)約能源，收到事半功倍的效果。因此，研究并優(yōu)化植物有效成分的提取工藝十分必要。超聲提取法是應用超聲波強化提取植物的有效成分，是利用超聲的空化效果從而破壞細胞壁結構，使其在瞬間破裂，植物細胞內的有效成分得以釋放、直接進入溶劑并充分混合，從而提高目標產物的得率。蘋果多酚主要存在于細胞壁中，普通的浸提方法很難全部溶出，本文研究在溶液中加載研磨珠來提高超聲空化效果，從而提高蘋果多酚得率，通過響應面優(yōu)化研磨珠輔助超聲波萃取蘋果多酚的最佳工藝，一方面可以為蘋果多酚的進一步研究奠定基礎，同時也可為其它植物酚類的提取提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

國光蘋果(Malus pumila cv.Ralls) 購于哈爾濱哈達果品批發(fā)市場;沒食子酸、甲醇、無水乙醇、丙酮、鎢酸鈉、鉬酸鈉、溴水、硫酸鋰、無水碳酸 均為分析純。

KQ－5200超聲波破碎儀 北京益植康生物科技有限公司;T6紫外可見分光光度計 北京普析通用公司;R－205B旋轉蒸發(fā)儀 上海申勝儀器公司;循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司; JA2003電子天平 上海精科廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 國光蘋果(Malus pumila cv.Ralls)，將蘋果清洗干凈，快速切成薄片漂燙滅酶，真空干燥箱40℃烘干，粉碎，放入－20℃冰箱中備用。

1.2.2 研磨珠輔助萃取蘋果多酚的單因素實驗

1.2.2.1 溶劑的選擇 精確稱取22份1.00g的蘋果粉置于100mL燒杯中，按液固比50∶1(mL/g)分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇、丙酮和甲醇的水溶液和水，置于超聲波破碎儀中，在常溫、150W功率條件下提取20min，按照

1.2.4中方法測定、計算不同溶劑條件下提取液中多酚得率。

1.2.2.2 研磨珠加載量對蘋果多酚得率的影響 精確稱取5份1.00g的蘋果粉置于100mL燒杯中，按液固比50∶1加入90%丙酮作為提取劑，然后分別按珠料比4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1(g/g)加入直徑為3～4mm研磨珠，置于超聲波破碎儀中，在常溫、150W功率條件下提取20min，按照1.2.4項下方法測定、計算不同研磨珠加載量條件下提取液中多酚得率。

1.2.2.3 研磨珠直徑對蘋果多酚得率的影響 精確稱取3份1.00g的蘋果粉于100mL燒杯中，按液固比50∶1加入90%丙酮作為提取劑，然后按研磨珠加載量珠料比為1∶1分別加入直徑為1～2mm、3～4mm、5～6mm的研磨珠，置于超聲波破碎儀中，在常溫、150W功率條件下提取20min，按照1.2.4項下方法測定、計算不同研磨珠直徑條件下提取液中多酚得率。

1.2.2.4 固液比對研磨珠法萃取蘋果多酚得率的影響 精確稱取6份1.00g的蘋果粉于100mL燒杯中，按研磨珠加載量珠料比為1∶1加入直徑為5～6mm的研磨珠，然后分別按液固比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1加入90%丙酮，置于超聲波破碎儀中，在常溫、150W功率條件下提取20min，按照1.2.4中方法測定、計算不同固液比條件下提取液中多酚得率。

1.2.2.5 超聲時間對研磨珠法萃取蘋果多酚得率的影響 精確稱取6份1.00g的蘋果粉于100mL燒杯中，按液固比50∶1加入90%丙酮作為提取劑，然后按研磨珠加載量珠料比為1∶1加入直徑為5～6mm的研磨珠，置于超聲波破碎儀中，在常溫、150W功率條件下分別提取10、20、30、40、50、60min，按照設定的時間取出提取樣品，按照1.2.4中方法測定、計算不同超聲時間條件下提取液中多酚得率。

1.2.2.6 超聲溫度對研磨珠法萃取蘋果多酚得率的影響 精確稱取7份1.00g的蘋果粉于100mL燒杯中，按液固比50∶1加入90%丙酮作為提取劑，然后按研磨珠加載量珠料比為1∶1加入直徑為5～6mm的研磨璃珠，置于超聲波破碎儀中，分別按30、35、40、45、50、55、60℃溫度，在 150W 功率條件下提取20min，按照1.2.4中方法測定、計算不同超聲溫度條件下提取液中多酚得率。

1.2.2.7 超聲功率對研磨珠法萃取蘋果多酚得率的影響 精確稱取7份1.00g的蘋果粉置于100mL燒杯中，按液固比50∶1加入90%丙酮作為提取劑，然后按研磨珠加載量珠料比為1∶1加入直徑為5～6mm的研磨珠，置于超聲波破碎儀中，分別按100、150、200、250、300、350、400W功率，在50℃溫度條件下提取20min，取出各功率條件下提取的樣品，按照1.2.4中方法測定、計算不同超聲功率條件下提取液中多酚得率。

1.2.3 提取工藝最優(yōu)參數的確定 在單因素實驗時，按照工藝優(yōu)化實驗設計的因素水平條件進行研磨珠輔助萃取，提取結束后取出樣品，將提取液用循環(huán)真空泵抽濾，取上清液測定多酚含量。以多酚得率作為評價指標進行研究和分析，以影響研磨珠輔助超聲波萃取多酚的最主要四個指標為因素，確定四因素四水平的最佳參數進行響應面分析［5］。實驗中的水平及編碼見表1。1.2.4 多酚含量測定 采用Folin－酚法［6－9］測定蘋果中多酚的含量。準確稱取0.110g沒食子酸，先加入少量蒸餾水待沒食子酸完全溶解后，加入蒸餾水定容至1000mL，混合均勻得濃度為100μg/mL的沒食子酸標準液。量取該標準溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.2mL置于10mL比色管中，加蒸餾水5mL，搖勻后加1.0mL福林－酚試劑，4min后加入3.0mL質量分數為7.5%的碳酸鈉溶液，25℃水浴條件下保持2h，測定溶液在765nm波長處的吸光值(A765)。進行3組平行實驗，以吸光度為縱坐標，沒食子酸含量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線。樣品測定按照上述方法操作，蘋果總多酚含量以每g樣品中沒食子酸當量計。計算公式如下:

表1 響應面實驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

式中:C:由標準曲線求得的含量(μg);m:樣品質量(g);v1:樣品定容的總體積(mL);v2:測定時吸取的樣品體積(mL)。

2 結果與分析

2.1 多酚標準曲線方程

通過福林酚法，以吸光度值與沒食子酸含量(μg)回歸得標準曲線方程為:y=0.1961x－0.1929，R2=0.9992。

2.2 研磨珠輔助萃取蘋果多酚的單因素實驗結果

2.2.1 溶劑對蘋果多酚得率的影響 不同溶劑對蘋果多酚得率的影響結果見圖1。

圖1 不同溶劑對多酚得率的影響Fig.1 Effect of different solvent on polyphenol yield

單純的有機溶劑和水作為提取劑，蘋果多酚得率均很低，這是由于水分子可破壞多酚分子間的氫鍵、減弱多酚間的締合能力，有助于多酚物質的溶出，因此，通常采用水－有機溶劑體系提取植物多酚。90%丙酮水溶液作為提取劑時，總酚得率最高，因此，確定單因素最佳溶劑為體積分數90%丙酮水溶液。

2.2.2 研磨珠加載量對蘋果多酚得率的影響 由圖2可見，隨著研磨珠加載量的減少提取物中酚類物質含量增加，當珠加載量為1∶1時，蘋果多酚得率達到最大值，而珠加載量為0時，Ralls蘋果提取物中各酚類物質含量和總抗氧化能力下降極為顯著。當研磨珠加載量為1∶1時，與不添加研磨珠比較，蘋果多酚得率提高了33.68%。說明通過加載研磨珠輔助萃取，確實可以增加超聲空化效果，提高目標產物得率，結合實驗結果確定研磨珠加載量的單因素最佳條件為1∶1(g/g)。

圖2 研磨珠加載量對多酚得率的影響Fig.2 Effect of grind balls load on polyphenol yield

2.2.3 研磨珠直徑對蘋果多酚得率的影響 由圖3可見，隨著研磨珠直徑的加大，蘋果多酚得率增大，當珠直徑為5～6mm時，蘋果多酚得率最高，由于實驗采用的珠最大直徑為5～6mm，結合實驗結果，因此確定單因素最佳珠直徑為5～6mm。

圖3 研磨珠直徑對多酚得率的影響Fig.3 Effect of grind balls’s diameter on polyphenol yield

2.2.4 液固比對研磨珠法萃取蘋果多酚得率的影響 由圖4可見，當液固比到50∶1時，蘋果多酚得率較高，且繼續(xù)增加液固比在60∶1～70∶1范圍內時，多酚得率基本不變。綜合經濟成本及后續(xù)濃縮處理等因素的考慮，確定液固比單因素的最佳條件為50∶1。

2.2.5 超聲時間對研磨珠法萃取蘋果多酚得率的影響 由圖5可見，超聲波作用時間對蘋果多酚得率具有顯著的影響。當超聲波作用時間為20min時多酚得率達到最高，然后隨著超聲波作用時間的延長，多酚得率下降，這可能是因為超聲時間過長，產生自由基，使溶出的多酚類物質又被氧化所致。所以超聲波提取時間單因素實驗結果確定為20min比較適宜。

圖4 液固比對多酚得率的影響Fig.4 Effect of ratio of liquid to material on polyphenol yield

圖5 超聲時間對多酚得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on polyphenol yield

2.2.6 超聲溫度對研磨珠法萃取蘋果多酚得率的影響 由圖6可見，當溫度在30～50℃之間時，隨溫度升高多酚得率增加，并且在50℃時達到最大值，當繼續(xù)升高溫度，蘋果多酚得率隨之下降，這可能是由于溫度過高酚羥基容易被氧化。所以確定單因素最佳超聲溫度為50℃。

圖6 超聲溫度對多酚得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol yield

2.2.7 超聲功率對研磨珠法萃取蘋果多酚得率的影響 由圖7可知，超聲波功率在100～250W時，隨著功率的增大，蘋果多酚得率增加，功率為250W時蘋果多酚得率達到最大值，繼續(xù)增大超聲波功率到300～400W時，蘋果多酚得率隨之下降，因此，選擇250W為最佳超聲波功率。

2.3 響應面優(yōu)化研磨珠輔助萃取蘋果多酚工藝

2.3.1 實驗設計及結果 根據Box－Benhnken的中心組合設計原理，以單因素實驗結果為基礎，并選取超聲溫度、超聲時間、超聲功率及研磨珠加載量4個因素為實驗因子，以總酚得率為響應值設計響應面實驗，以優(yōu)化研磨珠萃取法萃取蘋果多酚的提取工藝。利用Minitab7.0軟件進行4因素響應面實驗設計，共27組實驗，各組實驗設計及多酚得率結果見表2。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

圖7 超聲功率對研磨珠法萃取蘋果多酚得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on polyphenol yield

2.3.2 響應面結果分析 將各組實驗數據輸入Minitab軟件分析程序進行回歸擬合，可得到響應值Y和各因子(X1、X2、X3、X4)之間的二次多元方程: Y=0.999+0.120X1+0.0123X2－0.0146X3+0.0550X4－0.250X12－0.0568X22－0.0717X32－0.139X42－0.0005X1X2+0.0060X1X3+0.0487X1X4+0.0087X2X3－0.0103X2X4－0.0210X3X4。響應面回歸顯著性分析見表3。

表3回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸顯著(p＜0.0001)，失擬項不顯著，并且該模型R2=0.9348，R=0.8586，說明該模型與實際實驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于蘋果多酚提取工藝實驗的預測。

方差分析結果還表明，方程的一次項中，超聲時間(X1)和研磨珠加載量(X4)對蘋果多酚得率影響極顯著;二次項中，超聲時間(X1)和研磨珠加載量(X4)對多酚得率影響差異極顯著，而超聲溫度(X2)和超聲功率(X3)的平方項對多酚得率影響差異顯著。由此可見，各具體實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

表2 響應面實驗設計與結果Table 2 Results of response surface experiments

各因素的影響程度分析，各因素的F值可以反映出各因素對實驗指標的重要性，F值越大，表明對實驗指標的影響越大，即重要性越大。從方差分析表可知:FX1=50.38，FX2=0.729，FX3=0.74，FX4= 10.57，即各因素對蘋果多酚提取率的影響程度大小順序為:超聲時間＞研磨珠加載量＞超聲功率＞超聲溫度。

2.3.3 各因素之間的交互作用 在各因素交互作用分析中，由表3可以看出，各因素交互作用影響均不顯著(p＞0.05)。根據回歸方程，做出響應面分析圖(圖8)，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析超聲時間、超聲溫度、超聲功率、研磨珠加載量對蘋果多酚提取率的影響。

圖8 響應曲面圖Fig.8 Response surface

2.3.4 優(yōu)化工藝結果 通過Matlab7.0軟件，對響應面優(yōu)化工藝結果擬合分析得最佳提取工藝為:超聲時間 22.62min，超聲溫度 50.38℃，超聲功率243.85W，珠加載量1.25∶1。響應面模型在此條件下對多酚得率的預測值為1.023mg/g。為進一步驗證，采用確定的優(yōu)化條件進行三次平行實驗，同時考慮到實際操作的情況，將多酚得率的最佳條件修正為:超聲時間23min，超聲溫度50℃，超聲功率244W，珠加載量1.25∶1。結果顯示平均多酚提取得率為1.031mg/g，與理論預測值比較誤差為0.7%，說明實驗結果與模型符合良好，并達到實驗過程中的最高得率，說明此響應面模型具有可行性。因此，采用響應面優(yōu)化得到的研磨珠輔助萃取蘋果多酚提取工藝條件準確可靠，具有實用價值。

3 結論與討論

響應面優(yōu)化研磨珠輔助萃取蘋果多酚的最佳工藝條件為:溶劑為體積分數90%丙酮水溶液，液固比為50∶1，超聲時間23min，超聲溫度50℃，超聲功率244W，珠直徑為5～6mm，珠加載量1.25∶1(g/g)，在此條件下蘋果多酚得率為1.031mg/g。單因素結果表明，當研磨珠加載量為珠∶料=1∶1(g/g)時，與不添加研磨珠比較，蘋果多酚得率提高了33.68%。響應面結果顯示研磨珠加載量對蘋果多酚得率的影響極其顯著，這也說明玻璃珠的加入確實可以輔助提高超聲波的空化效果，提高目標產物的提取率。

植物多酚的提取方法一般采用超聲波提取法，有研究表明超聲波法可以有效的提取蘋果中的多酚成分［10－12］。而本文通過在溶液中加入研磨珠來輔助超聲波法提取蘋果多酚，結果表明要優(yōu)于單純的超聲波法。研磨珠輔助萃取蘋果多酚工藝的建立，不但可提高蘋果多酚的得率，同時也可為其它植物有效成分的提取提供借鑒。

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Optimization of apple polyphenols extraction with grind balls by response surface methodology

ZHOU Li－ping1，YANG Rui－h(huán)ua2，ZHANG Yue1，*
(1.Institute of Natural and Ecology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150040，China;
2.Horticulture Branch，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150040，China)

The response surface methodology based on single factor experiment was used to optimize processing parameters of extraction with grind balls for apple polyphenols.Results showed that the optimal processing conditions of ultrasonic extraction were ultrasonic time 23min，extraction temperature 50℃ and ultrasonic power 244W，balls to material ratio 1.25∶1.The yields of apple polyphenols under the optimal extraction conditions were up to 1.031mg/g and 33.68%increased comparing with traditional ultrasonic extraction method.

response surface method;apple polyphenols;extract;grind balls

TS201.1

B

1002－0306(2012)21－0277－05

2012－03－29 *通訊聯系人

周麗萍(1976－)，女，碩士，助理研究員，研究方向:植物活性成分。