蔞葉抗氧化活性成分的提取及活性測定體系的優(yōu)化

紀明慧，郭飛燕，王呈文，白小月，高 倩，徐志江，凌昭星

(海南師范大學“省部共建－熱帶藥用植物化學”教育部重點實驗室，海南?？?571158)

蔞葉抗氧化活性成分的提取及活性測定體系的優(yōu)化

紀明慧，郭飛燕*，王呈文，白小月，高 倩，徐志江，凌昭星

(海南師范大學“省部共建－熱帶藥用植物化學”教育部重點實驗室，海南?？?571158)

目的:研究蔞葉乙醇提取物的抗氧化活性。方法:采用微波輔助乙醇提取法提取蔞葉抗氧化活性成分，以魯米諾化學發(fā)光體系測定蔞葉乙醇提取物清除羥自由基的效果，并對測定體系進行優(yōu)化。結果:當料液比為13∶25(mg/mL)，乙醇濃度為50%，提取溫度為55℃，提取時間為25min，微波提取功率為600W時，蔞葉乙醇提取物對羥基自由基的清除效果最佳，清除率可達98.2%，清除率測定體系中，當pH10.18，Luminol濃度為0.8×10－4mol/L，H2O2濃度為0.3%時，體系測量精密高、穩(wěn)定性和重復性好。結論:蔞葉乙醇提取物對·OH有很好的清除作用。

蔞葉，抗氧化，魯米諾，流動注射化學發(fā)光法

蔞葉(Piper betleL.)為胡椒科胡椒屬植物，又名蒟醬、青蒟、檳榔蒟、檳榔蔞等［1］，是普遍生長在亞洲的一種植物，在我國主要分布于云南、廣西、海南、臺灣等地。蔞葉是我國南方常見的藥用植物，在《本草綱目》、《中藥大辭典》和《本草綱目拾遺》中均有記載，蔞葉根、子、葉皆可入藥，具有祛風散寒、行氣化痰、消腫止癢之功效。民間用于治療風寒咳嗽、支氣管哮喘、風濕骨痛、胃寒痛、妊娠水腫、牙痛等，外用治皮膚濕疹、腳癬［1－2］。在海南的南部，咀嚼蔞葉和檳榔是一種習俗，具有抑菌護齒的作用。有關蔞葉揮發(fā)油成分、化學成分和營養(yǎng)成分已有一些文獻報導［1－4］，但有關蔞葉在抗氧化活性方面的研究報導并不多見，梁輝等人［5］以DPPH法及聯(lián)苯三酚紅褪色法對云南保山產的蔞葉進行抗氧化研究。為此，筆者采用微波輔助乙醇提取法對海南產蔞葉進行提取，考察最佳的提取工藝條件，并用H2O2－魯米諾化學發(fā)光體系測定蔞葉乙醇提取物對·OH的抑制作用，以期為更好地開發(fā)和利用海南蔞葉提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔞葉 海南萬寧，經海南師范大學生命科學學院鐘瓊芯老師鑒定為胡椒科胡椒屬植物;魯米諾(Luminol) 分析純，蘇州工業(yè)園區(qū)亞科化學試劑有限公司;氫氧化鈉、30%H2O2、無水乙醇 分析純，廣州化學試劑廠;硫酸銅 分析純，北京化工廠;維生素C 分析純，天津市四通化工廠;0.1mol/L的Na2CO3－NaHCO3緩沖溶液。

MAS－I型微波萃取儀 上海新儀微波化學科技有限公司;pHS－3C型pH計 上海康儀儀器有限公司;BS124S型電子天平 賽多利斯科學儀器有有限公司;IFFM－E型流動注射化學發(fā)光儀 西安瑞邁電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 流動注射化學發(fā)光體系的建立 如圖1所示，在實驗過程中，魯米諾溶液和待測液由主蠕泵泵入管路，H2O2、硫酸銅、維生素C溶液則由副蠕泵泵入管路，按運行程序(表1)進行流動注射化學發(fā)光分析，各溶液分別在混合器中混合并發(fā)生反應產生藍光，測定10s內發(fā)光強度，由光檢測器記錄發(fā)光信號。在副蠕泵中部分Cu2+被維生素C還原成Cu+，然后迅速與H2O2反應產生羥基自由基［6］。當主蠕泵中進的是魯米諾溶液和空白溶液時，發(fā)光強度為空白值I0，當進的是待測液時，發(fā)光強度記為I，根據發(fā)光信號強度的降低值(I0－I)，可以定量分析待測液中的成分清除羥基自由基的能力。其計算公式為［7－8］:

表1 流動注射化學發(fā)光儀運行參數(shù)程序Table 1 Operating parameters of flow injection chemiluminescence instrument

羥基自由基抑制率(%)=［(I0－I)/I0］×100

圖1 流動注射化學發(fā)光分析法的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of flow－injection chemiluminescence analysis

1.2.2 蔞葉抗氧化活性成分提取 蔞葉烘干，粉碎過80目篩，準確稱取一定量的蔞葉粉末于50mL燒杯中，加入25mL乙醇溶液，在不同溫度、時間、微波功率下提取，然后抽濾，濾渣再用相同濃度乙醇溶液洗滌三次，合并濾液定容至50mL，待測［9－10］。

1.2.3 蔞葉抗氧化活性測定 以1.2.1流動注射化學發(fā)光體系測定蔞葉抗氧化活性。魯米諾溶液、H2O2溶液和1.0×10－5mol/L硫酸銅以及1.0×10－5mol/L維生素C溶液都根據需要以0.1mol/L的Na2CO3－NaHCO3緩沖溶液配制以達到所需的pH。硫酸銅溶液和維生素C溶液加入量比為7∶4(mL/mL)，按運行程序(表1)進行流動注射化學發(fā)光分析，進而分析pH、H2O2濃度和魯米諾濃度對測量體系的影響。

2 結果與分析

2.1 提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 料液比對·OH的清除效果影響 在其它條件不變的情況下，料液比對提取效果的影響見圖2。提取條件:80%乙醇、提取溫度 50℃、提取時間25min、微波功率600W。由圖2可以看出，當料液比為10∶25～13∶25時，提取物對羥基自由基的清除率隨料液比的增加逐漸增加，增加料液比，提取物對羥基自由基的清除率出現(xiàn)下降的趨勢，說明當料液比增大，提取液中有效的活性成分含量增加，同時其他成分含量也會增加，其中某些成分對清除羥基自由基的活動產生拮抗，從而導致清除效果變差。因此，本實驗選擇提取液的最佳料液比為13∶25(mg/mL)。

圖2 不同料液比提取物對·OH清除效果Fig.2 The scavenging effect of extracts with different solid to liquid ratio on·OH

2.1.2 乙醇濃度對·OH的清除效果影響 在其它條件不變的情況下，考察不同乙醇濃度對提取效果的影響，結果見圖3。提取條件:料液比13∶25、提取溫度50℃、提取時間25min，微波功率600W。由圖3可以看出，當乙醇濃度為30%～50%，提取液對·OH的清除率隨乙醇濃度的增加逐漸增加，當乙醇濃度為50%時，清除率最高。當乙醇濃度為50%～90%時，提取物對·OH的清除率隨乙醇濃度的增加逐漸下降，說明提取液中對·OH產生抑制作用的活性組分具有較大的極性。

圖3 不同乙醇濃度提取物對·OH清除效果Fig.3 The scavenging effect of extracts with different volume fraction of ethanol on·OH

2.1.3 溫度對·OH的清除效果影響 在其它條件不變的情況下，考察溫度對提取效果的影響，結果見圖4。提取條件:50%乙醇、料液比13∶25、提取時間25min，微波功率600W。由圖4可知，35℃時提取物對·OH的清除率很低，隨著提取溫度的升高，提取物對·OH的清除率增加，55℃時清除率最高可達98.2%;溫度低于55℃，蔞葉中有效的抗氧化活性成分溶解度小，提取效果受到影響，因此活性不高;溫度高于55℃時，隨著溫度的提高，有效成分溶解達到飽和，提取物對羥基自由基的清除率變化不大。

圖4 不同溫度提取物對·OH清除效果Fig.4 The scavenging effect of extracts with different temperature on·OH

2.1.4 時間對·OH的清除效果影響 在其它條件不變的情況下，考察時間對提取效果的影響，結果見圖5。提取條件:50%乙醇、料液比13∶25、提取溫度55℃、微波功率600W。由圖5可知，隨著提取時間的延長，提取物對羥基自由基的清除率逐漸增加，

25min時清除率最高;時間小于25min，蔞葉中有效的抗氧化活性成分提取不夠充分，因此提取物活性受到影響;提取到25min時，提取基本完成，再延長提取時間，提取物對羥基自由基的清除率沒有明顯的變化，而體系溶液顏色變深，影響了測量效果。

圖5 不同時間提取物對·OH清除效果Fig.5 The scavenging effect of extracts with different time on·OH

2.1.5 微波功率對·OH的清除效果影響 在其它條件不變的情況下，考察微波功率對提取效果的影響，結果見圖6。提取條件:50%乙醇、料液比13∶25、提取溫度55℃、提取時間25min。由圖6可知，當微波提取功率為300～600W時，提取物對·OH的清除率隨著微波功率的提高逐漸增加，最高可達98.2%，當微波提取功率為600～800W時，提取物的清除率隨著微波功率的提高呈現(xiàn)出下降趨勢，表明增大微波提取功率會導致蔞葉提取液中有效成分氧化分解，影響了清除效果。

2.2 抗氧化活性測定體系的優(yōu)化

2.2.1 pH的選擇 在其它條件不變的情況下，考察體系溶液的pH對測量效果的影響見圖7。測定體系中H2O2濃度為0.3%、魯米諾濃度為0.8×10－4mol/L、CuSO4和維生素C濃度均為1×10－5mol/L，CuSO4和維生素C比例為7∶4(mL/mL)。由圖7可知當體系溶液的pH為8.64～12.17時，隨著pH增加，體系發(fā)光強度變化不明顯，羥基自由基清除率變化不大。但是過高的pH會使體系的發(fā)光處于不穩(wěn)定狀態(tài)，從而影響實驗的穩(wěn)定性和重復性，三次平行實驗，結果表明，當pH為10.18時提取物對羥基自由基清除率最好。

圖6 不同微波功率提取物對·OH清除效果Fig.6 The scavenging effect of extracts with different microwave power on·OH

圖7 pH對測定結果的影響Fig.7 The effect of pH on the measured results

2.2.2 H2O2濃度的選擇 在其它條件不變的情況下，考察體系中H2O2濃度的變化對發(fā)光強度的影響，結果見圖8。測定體系中魯米諾溶液濃度為0.8×10－4mol/L，pH為10.18，1×10－5mol/L CuSO4和維生素C加入比例7∶4。由圖8可以看出，當H2O2的濃度為0.06%時，提取物對羥基自由基的清除率很低，光強度很小，這表明體系中若無過氧化氫的存在就沒有羥基自由基的生成，無法產生化學發(fā)光。當H2O2的濃度為0.06%～0.3%時，體系的化學發(fā)光值隨著H2O2濃度的增大而劇增，提取物對羥基自由基的清除率迅速提高，清除效果非常明顯，而后隨著H2O2濃度的繼續(xù)增大，發(fā)光強度逐漸減少，清除率開始下降。這是因為H2O2本身對羥基自由基也有一定的抑制作用［9］，H2O2濃度過大，不僅會抑制發(fā)光，也會使體系的發(fā)光處于一種不穩(wěn)定的狀態(tài)。三次平行實驗，結果表明，H2O2的最合適濃度為0.3%。

圖8 H2O2濃度對測定結果的影響Fig.8 Impact of H2O2concentration on test results

2.2.3 魯米諾濃度的選擇 在其它條件不變的情況下，考察體系中魯米諾溶液濃度對發(fā)光強度的影響，結果見圖9。測定體系中H2O2的濃度為0.3%、pH為10.18、1×10－5mol/L CuSO4和1×10－5mol/L維生素C加入量為7∶4。由圖9可以看出，體系的化學發(fā)光依賴于魯米諾的存在，當魯米諾濃度為0.4×10－4～1.2×10－4mol/L時，隨著魯米諾濃度的增加，體系的化學發(fā)光值呈逐漸增大的趨勢，羥基自由基的清除率也逐漸增大;而當魯米諾濃度達到0.8×10－4mol/L時，發(fā)光值達到最大值，發(fā)光強度趨于穩(wěn)定，測量體系相對穩(wěn)定，提取液對羥基自由基的清除率達到最大，可達98.2%，繼續(xù)增大魯米諾濃度，體系的發(fā)光強度降低，且實驗的重現(xiàn)性較差。提取液對羥基自由基的清除率下降，三次平行實驗，結果表明，最合適的魯米諾濃度為0.8×10－4mol/L。

圖9 魯米諾濃度對測定結果的影響Fig.9 Impact of Luminol concentration on test results

3 結論

實驗結果表明，以微波輔助提取，當料液比為13∶25，乙醇濃度為50%，溫度為55℃，時間為25min，微波功率為600W時，蔞葉乙醇提取物對·OH的清除率效果最佳，清除率可達98.2%，具有很強的抗氧化活性;當pH為10.18，H2O2濃度為0.3%時，魯米諾濃度為0.8×10－4mol/L，體系測量精密高、穩(wěn)定性和重復性好。蔞葉乙醇提取物為一混合體系，清除· OH的作用機理較復雜，有待進一步研究。

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Extraction of antioxidant active components frompiper betleand optimization of activity determination system

JI Ming－h(huán)ui，GUO Fei－yan*，WANG Cheng－wen，BAI Xiao－yue，GAO Qian，XU Zhi－jiang，LING Zhao－xing
(Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，Hainan Normal University，Haikou 571158，China)

Objective:To study the antioxidant activity of ethanol extracts fromPiper betleL.Method:The ultrasonicassisted ethanol extraction method was adopted to extract the antioxidant active components fromPiper betleL，chemiluminescence analysis in H2O2－Luminol system was used to determine efficiency of scavenging hydroxyl free radical and optimize the measurement system.Result:Under the conditions that solid－to－liquid ration was 13∶25(mg/mL)，ethanol concentration was 50%，extraction time was 25min and temperature was 55℃，microwave power 600W，the effect of removing hydroxyl radical was best and the dearance rate was 98.2% .H2O2concentration 0.30%and Luminol concentration 0.8×10－4mol/L and pH10.18 was suitable condition.Conclusion: The ethanol extract ofPiper betleL had very good scavenging effect of hydroxyl radical.

Piper betleL;antioxidation;Luminol;flow－injection chemiluminescence

TS201.2

B

1002－0306(2012)21－0246－04

2012－05－17 *通訊聯(lián)系人

紀明慧(1968－)，女，副研究員，研究方向:有機化學。

海南省教育廳科研基金項目(Hj2010－19)。